D-熒光素是流行的多功能生物發(fā)光底物。螢火蟲熒光素酶/熒光素生物發(fā)光系統(tǒng)存在于螢火蟲（Photinus pyralis）和其他幾種甲蟲中。熒光素酶通過二氧雜環(huán)丁酮中間體氧化ATP進行活化熒光素。螢火蟲熒光素酶通過熒光素的ATP依賴性氧化產(chǎn)生光。來自該反應的560nm化學發(fā)光在數(shù)秒內(nèi)達到峰值，當熒光素和ATP過量存在時，光輸出與熒光素酶活性成比例。

問：D-熒光素鉀鹽溶液的穩(wěn)定性如何？可保存多久？

答：1.D-熒光素鉀鹽易溶于水和緩沖液，溶解度可高達25mg/mL。一般使用濃度為3-15 mg/mL。

2.溶液的pH值、溶液中的氧氣和保存時間對其保存過程中的穩(wěn)定性非常重要。當溶液的pH<6.5（發(fā)生水解作用）或>7.5（發(fā)生消旋化作用，D型轉化為L型）的情況下，D-熒光素鉀鹽相對不穩(wěn)定。如果溶液中存在少量的氧氣，將加速D-熒光素鉀的降解速度。

3.D-熒光素配成溶液后，在佳的保存條件（-80°C，佳pH，無氧氣）下，存在固定的降解速度：0.2%/天，因此配成溶液保存的D-熒光素應盡量在1年內(nèi)使用完。

4.有水存在的情況下，主要發(fā)生消旋化作用，即D-熒光素轉化成L-熒光素，有報道稱L-熒光素對熒光素酶催化的酶促反應有抑制作用。

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問：D-熒光su鈉鹽和D-熒光素鉀鹽有什么區(qū)別？

答：D-熒光su鈉鹽(貨號12511)的水溶性高于D-熒光素鉀鹽(貨號12507)，鈉鹽可以溶解到100 mg/mL，而鉀鹽只能溶解到60 mg/mL。

D-熒光su鈉鹽的外形更顆粒狀，而D-熒光素鉀鹽的外形更細膩。

兩者在動物活體成像分析和體外生物發(fā)光檢測方面的效果基本相同，但有些文獻和研究者更傾向于使用鉀鹽。

問：D-熒光su鈉鹽鉀鹽在進行體外標記的時候，需要注意什么？

答：1.純度和質量：使用高純度的D-熒光su鈉鹽，確保染料的質量良好，避免雜質對標記結果的影響。

2.溶液配制：請按照說明書準確配制熒光su鈉鹽的工作溶液。注意緩沖液的選擇，以確保標記過程中維持適當?shù)膒H值和離子濃度。

3.保護染料活性：D-熒光su鈉鹽可能對光敏感，因此在標記過程中避免長時間的強光照射，最好在低光條件下操作。另外，標記溶液最好是在避光條件下保存，避免陽光直射。

4.反應時間：確保標記反應的時間充分但不過長，以防止過度標記和非特異性結合?？梢酝ㄟ^試驗不同的反應時間找到適合的標記時間。

5.染料與目標物的比例：確定適當?shù)臒晒鈙u鈉鹽與目標物（如蛋白質、細胞等）的比例，以實現(xiàn)最佳的標記效果。過量的染料可能會引起背景噪音，而過少的染料則可能導致信號較弱。

6.洗滌步驟：完成標記后，必須進行適當?shù)南礈觳襟E，去除未結合的熒光su鈉鹽和其他雜質，以減少背景干擾。

7.驗證標記效果：在標記完成后，使用熒光顯微鏡或其他熒光成像設備驗證標記效果，確保目標物正確被標記并發(fā)出熒光。

8.質量控制：在進行體外標記實驗時，最好同時進行陰性對照和陽性對照實驗，以確保標記的特異性和可靠性。

9.存儲條件：對于已標記的樣品，選擇適當?shù)拇鎯l件，確保標記的穩(wěn)定性和長期保存的可靠性。

問：能否總結一下市面現(xiàn)售的各種D-熒光素？它們都有什么特點？什么區(qū)別？

答：目前市面常見的D-熒光素的形式有：鉀鹽、鈉鹽、游離酸、甲酯、乙酯、半乳糖苷等，下面將分別介紹它們之間的區(qū)別，供參考。

1. D-熒光su鈉鹽和鉀鹽，D-熒光su鈉鹽和鉀鹽的區(qū)別主要在于它們的溶解度和穩(wěn)定性。D-熒光su鈉鹽的溶解度略高于鉀鹽，但是鉀鹽的穩(wěn)定性略高于鈉鹽。這是因為鈉離子對熒光素酶的活性有一定的抑制作用，而鉀離子則沒有。因此，如果實驗條件允許，建議使用鉀鹽而不是鈉鹽。

2. D-熒光素游離酸，它在水和緩沖液中的溶解性很差，需要用弱堿如NaOH或KOH來調(diào)節(jié)pH才能溶解。而鈉鹽、鉀鹽則可以很容易地溶解在水或緩沖液中，無需額外處理。因此，鈉鹽、鉀鹽更適合體內(nèi)實驗，而游離酸則需要更多的注意事項。

3. D-熒光素甲酯和乙酯，首先，甲酯或乙酯需要被脂肪酶水解后，才能釋放出D-熒光素。其次，兩者的區(qū)別主要在于它們的水解速率和發(fā)光強度。D-熒光素甲酯的水解速率比D-熒光素乙酯快，因此它的發(fā)光峰值出現(xiàn)得更早，但是也持續(xù)得更短。而D-熒光素乙酯的水解速率比D-熒光素甲酯慢，因此它的發(fā)光峰值出現(xiàn)得更晚，但是也持續(xù)得更長。

4. D-熒光素半乳糖苷，它是一種用于檢測β-半乳糖苷酶活性的熒光底物，它需要經(jīng)過β-半乳糖苷酶的水解才能釋放出D-熒光素。

5.  D-熒光素磷酸鹽，它在6-O位置上連接了一個磷酸基，使得它不能被螢火蟲熒光素酶識別。但是當磷酸基被堿性磷酸酶或蛋白磷酸酶水解后，就會釋放出D-熒光素，這是一種可以被螢火蟲熒光素酶催化發(fā)光的底物。因此，D-熒光素磷酸鹽可以用于檢測堿性磷酸酶和蛋白磷酸酶的活性。

6.  D-熒光素醋酸，它在6-O位置上連接了一個乙酸基，使得它不能被螢火蟲熒光素酶識別。但是當乙酸基被酯酶水解后，就會釋放出D-熒光素，這是一種可以被螢火蟲熒光素酶催化發(fā)光的底物。因此，D-熒光素醋酸可以用于檢測酯酶的活性。

問：D-熒光素鉀鹽如何標記小鼠？用量是多少？

答：1. 體外生物發(fā)光檢測：用無菌純凈水對D-熒光素鉀鹽進行溶解，配制30mg/mL的儲備溶液，分裝后在-20℃避光條件下保存。在37℃恒溫條件下預熱處理組織培養(yǎng)基10-20分鐘，再將處理后的培養(yǎng)基倒入儲存液中，稀釋至0.15-0.3 mg/mL的工作液濃度。之后再去除混液中的細胞培養(yǎng)基。等待圖像分析前，向細胞內(nèi)添加熒光素工作液，恒溫37℃條件下孵育5-10 min，之后再進行圖像分析。

2. 活體成像分析：采用無菌的DPBS緩沖液配制成為15 mg/mL的熒光素的儲存液，混勻。使用水系0.2 µm真是濾器過濾對儲備液進行除菌處理，處理后可即使使用，或者在-20℃避光條件下保存。腹腔注射（i.p.）：按照150 mg/kg 的熒光素/體重濃度比例進行注射；注射入體內(nèi)10-15 min后（等待光信號達到Z強穩(wěn)定平臺期）之后，再進行成像分析。

問：D-熒光素的熒光與什么有關？它對動物有什么影響？

答：D-熒光素是螢火蟲熒光素酶的化學發(fā)光底物。它在存在 ATP 的情況下通過熒光素酶氧化脫羧產(chǎn)生光。 D-熒光素的熒光與熒光素酶的濃度、ATP的水平、Mg2+的存在、氧氣的供應和反應溫度等因素有關。D-熒光素不會影響動物（沒有明顯毒性或免疫反應）。

問：D-熒光素鉀鹽可以用于測定啟動子相連的熒光素酶基因的表達嗎？

答：是的，D-熒光素鉀鹽可以用于測定啟動子相連的熒光素酶基因的表達。該操作的基本步驟如下：

1. 構建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質粒，如pGL3-basic等。

2. 將要檢測的轉錄因子表達質粒與報告基因質粒共轉染細胞，如HEK293T細胞或其它相關的細胞系。如果此轉錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉錄因子的作用強度成正比。

3. 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應，產(chǎn)生熒光，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。

問：D-熒光素適合做哪些實驗?

答：D-熒光素鉀鹽和5-氟-熒光素，作為Luciferase的作用底物，常用于以下實驗：

1. 報告基因分析

2. In vivo imaging (動物活體成像)

3. In vitro imaging (細胞體外分析)

4. ATP測定

5. 其它luciferase及其基因相關的分析和研究工作

問：D-熒光素應用于活體成像的基本原理是什么？ 

答：細胞中D-熒光素酶參與的化學發(fā)光反應遵守酶促反應的基本原理，在底物D-熒光素鉀過量的情況下，反應產(chǎn)生的光子數(shù)（發(fā)光量）與細胞中的D-熒光素酶的量成正相關，從而可以推算出細胞的數(shù)量。

問：D-熒光素鉀鹽溶液的穩(wěn)定性是怎樣的？ 

D-熒光素鉀鹽易溶于水和緩沖液，溶解度可高達25mg/mL。一般使用濃度為3-15 mg/mL。

溶液的pH值、溶液中的氧氣和保存時間對其保存過程中的穩(wěn)定性非常重要。當溶液的pH<6.5（發(fā)生水解作用）或>7.5（發(fā)生消旋化作用，D型轉化為L型）的情況下，D-熒光素鉀鹽相對不穩(wěn)定。如果溶液中存在少量的氧氣，將加速D-熒光素鉀的降解速度。

D-熒光素配成溶液后，在佳的保存條件（-80°C，佳pH，無氧氣）下，存在固定的降解速度：0.2%/天，因此配成溶液保存的D-熒光素應盡量在1年內(nèi)使用完。

有水存在的情況下，主要發(fā)生消旋化作用，即D-熒光素轉化成L-熒光素，有報道稱L-熒光素對熒光素酶催化的酶促反應有抑制作用。

問：D-熒光素鉀鹽的保存和運輸條件是什么？  

保存條件：≤-20°C，避光，保持干燥。（在不打開包裝的條件下，可保存兩年時間）。

運輸條件：高純度的D-熒光素鉀鹽可在短時間內(nèi)常溫條件下保存，運輸條件為常溫。

原裝（沒有打開包裝）熒光素的包裝瓶中充有氬氣，保證其穩(wěn)定性，打開包裝后，請嚴格按照保存條件保存。

D-熒光素鉀鹽具有易溶于水的特性，其暴露于空氣中，易吸潮。在稱量過程中，請考慮其易吸潮的特性，先進行溫度平衡，再快速稱取。