注：PE和APC的完整操作步驟及標記方案在最后兩頁，如果不需要看介紹，可直接跳過
藻紅蛋白(R-PE及B-PE)
特點：
1.從紅藻中純化
2.具有高的發(fā)射量子產(chǎn)率
3.熒光團與蛋白質(zhì)主鏈共價結合，不被淬滅
4.高水溶性
R-PE與B-PE的區(qū)別：
Wavelength(nm)
Wavelerngn(mm)
R-PE與B-PE的對比：
| R-PE | B-PE |
分子量 | 240,000 | 240,000 |
最大吸收 | 565 nm | 545 nm |
額外的吸收峰 | 498 nm | 564nm |
最大發(fā)射 | 573 nm | 573 nm |
消光系數(shù)(ε) | 1.96x106 M-1cm-1 | 2.41x106 M-1cm-1 |
熒光量子產(chǎn)率(QY) | 0.84 | 0.98 |
吸收比 | A566/A280≥5.0 A566/A498<1.5 A620/A566<0.01 | A545/A280≥5.5 A565/A496<2.7 A620/A545<0.01 |
特點：
1.從藍藻中純化
2.具有高的發(fā)射量子產(chǎn)率
3.熒光團與蛋白質(zhì)主鏈共價結合，不被淬滅
4.高水溶性
APC和C-PC的區(qū)別：
APC和C-PC的對比：
| APC | C-PC |
分子量 | 104,000 | 264,000 |
最大吸收 | 651nm | 651nm |
最大發(fā)射 | 662nm | 647 nm |
消光系數(shù)(?) | 7.3x105 M-1cm-1 | 1.53x106cm-1M-1 |
熒光量子產(chǎn)率(QY) | 0.68 | 0.81 |
吸收比 | A650/A620≥1.25 A650/A280≥4.5 | A652/A620<0.3 A620/A280>4 |
交聯(lián)APC和APC的對比：
1.APC結構：它具有α和β亞基，具有明顯的(αβ)3四級結構。
2.為什么要將APC進行交聯(lián)？答：交聯(lián)是為了防止APC在稀釋或暴露于變性鹽(如尿素或鹽酸胍)時發(fā)生可逆解離，從而保持其結構和功能穩(wěn)定。
3.如何進行APC交聯(lián)？答：通過α和β亞基間的特異性交聯(lián)可以阻止APC的分解。
交聯(lián)比：>1.0
| NaClO4 | A650:A620 |
CL-APC | | 1.465849387 |
CL-APC+NaClO4 | + | 1.386850153/ |
| NaClO4 | A650:A620 |
APC | | 1.587272727 |
APC+NaClO4 | + | 0.317901235 |
注：圖中的紅色線條為沒有添加NaClO4，藍色線條為添加了NaClO4。
如圖及表中信息所示，CL-APC圖中添加NaClO4及沒添加NaClO4，吸收比沒有明顯變化。而在未交聯(lián)的APC中，添加NaClO4，得到的吸收比有非常大的變化，因為APC中加入了NaClO4導致了它出現(xiàn)了解離。
特點：
1.存在于大多數(shù)光合作用的甲藻中
2.高水溶性
3.大斯托克斯位移
光譜特性：
| PerCP |
分子量 | 35,000 |
最大吸收 | 483nm |
最大發(fā)射 | 676nm |
消光系數(shù)(ε) | 4.0x105 M-1cm-1 |
熒光量子產(chǎn)率(QY) | 1.0 |
亮度(exQY) | 4.9x105M-1cm-1 |
吸收比 | A482/A280>4.0 |
一、PE的制備
1.將PE純化。綴合前的濃度通常為5-10mg/ml。注意：PE在綴合前作為SAS(硫酸銨鈉)沉淀物穩(wěn)定。如果將PE以SAS沉淀物的形式儲存，則必須在使用前進行大量純化。
2.使用3.5毫克R-PE修飾每毫克lgG，包括在緩沖液交換過程中損失的額外10%。
3.檢查PE的純度和濃度，請測量280、565和620nm處的吸光度。(1mg/ml的PE在565nm處的OD為8.2)。565/620比率>50表示已充分去除污染的藻藍蛋白；565/280比率> 5表示已充分去除所有其他蛋白質(zhì)。
二、PE的活化
1.使用前在無水DMSO中制備10mg/ml的SMCC儲備溶液。
2.每毫克PE加入11μlSMCC，并進行渦旋。將反應管用鋁箔包好，室溫下旋轉60分鐘。
3.將純化的PE過凝膠過濾柱來交換緩沖液。
注意：對于失敗或效果較差的結合，增加或減少SMCC相對于PE的量，可能會有所好轉。
三、1gG還原
1.在蒸餾水中制備1MDTT(15.4mg/100μl)的新鮮溶液。
2.1gG溶液濃度應為4mg/ml或更高，這樣效果比較好。還原幾乎可以在任何緩沖液中進行；MES、磷酸鹽和TRIS緩沖液(pH范圍為6至8)已被驗證可以使用。如果抗體濃度低于2mg/ml，則應濃縮。緩沖液交換柱上的損失應額外增加10%。
3.用DTT配制20mMlgG溶液：每毫升IgG溶液加入20μlDTT原液并攪拌。室溫下靜置30分鐘無需額外攪拌(以盡量減少半胱an酸再氧化為胱an酸)。
4.將還原的lgG通過預平衡的“交換緩沖液"過濾柱。收集0.25毫升的級分，測定蛋白濃度，并將含有大部分lgG的級分匯集在一起。可以通過分光光度法或比色法完成。
5.此步驟后盡快進行綴合。
注意：對于結合較差或失敗的情況，降低DTT濃度可能會有所幫助。
四、進行綴合
1.每毫克IgG添加3.2毫克SMCC-PE。用鋁箔包裹反應管并在室溫下旋轉60分鐘。注意：這些摩爾比(每IgG約2個PE)效果很好。對于失敗或效果不佳的結合，不同的摩爾比可能會有所幫助。
2.60分鐘后，必須去掉lgG上未反應的游離巰基。
3.在1.0ml干DMSO中制備10mgNEM的新鮮溶液。
4.每毫克|gG添加34μg(3.4μl)。室溫下包裹并旋轉20分鐘。
2.60分鐘后，必須去掉lgG上未反應的游離巰基。
3.在1.0ml干DMSO中制備10mgNEM的新鮮溶液。
4.每毫克|gG添加34μg(3.4μl)。室溫下包裹并旋轉20分鐘。
注1：整個綴合過程可以在一天內(nèi)完成。但是，綴合前對APC的純化可能需要24-48小時。除了下面列出的材料外，您還需要濃度至少為2mg/ml的抗體溶液。請您在進行APC抗體綴合實驗之前熟悉如何使用脫鹽柱以及如何獲取吸光度光譜。
注2：SMCC-APC綴合物非常穩(wěn)定(在“交換緩沖液"中，在4C下至少可以穩(wěn)定幾個月)。因此，如果您需要節(jié)省一部分時間，可以選擇同時綴合10毫克或更多的APC，并將其用于幾次抗體實驗(在幾周內(nèi))。SMCC-APC的長期儲存最好是作為飽和硫酸銨沉淀物。
一、APC的制備
1.將APC純化。綴合前的濃度通常為5-10mg/ml。注意：APC在綴合前作為SAS(硫酸銨鈉)沉淀物穩(wěn)定。如果將APC以SAS沉淀物的形式儲存，則必須在使用前進行大量純化。在用每毫升1升的“透析緩沖液"透析之前，用每毫升1升APC的PBS進行透析2次。
2.使用1.7毫克APC修飾每毫克lgG，包括在緩沖液交換過程中損失的額外10%。
3.檢查APC的純度和濃度，請測量280、620和655nm處的吸光度。(1mg/ml的APC在655nm處的OD為5.9)。655/620比率>1.4表明雜質(zhì)被充分去除；655/280比率>4表明所有其他蛋白質(zhì)均已充分去除
二、APC的活化
1.使用前在無水DMSO中制備10mg/ml的SMCC儲備溶液。
2.每毫克APC加6μlSMCC，并進行渦旋。將反應管用鋁箔包好，室溫下旋轉60分鐘。
3.將純化的APC過凝膠過濾柱來交換緩沖液。
注意：對于失敗或效果較差的結合，增加或減少SMCC相對于APC的量，可能會有所好轉。
三、1gG還原
1.在蒸餾水中制備1MDTT(15.4mg/100μl)的新鮮溶液。
2.1gG溶液濃度應為4mg/ml或更高，這樣效果比較好。還原幾乎可以在任何緩沖液中進行；MES、磷酸鹽和TRIS緩沖液(pH范圍為6至8)已被驗證可以使用。如果抗體濃度低于2mg/ml，則應濃縮。緩沖液交換柱上的損失應額外增加10%。
3.用DTT配制20mMlgG溶液：每毫升IgG溶液加入20μlDTT原液并攪拌。室溫下靜置30分鐘，無需額外攪拌(以盡量減少半胱an酸再氧化為胱an酸)。
4.將還原的lgG通過預平衡的“交換緩沖液"過濾柱。收集0.25毫升的級分，測定蛋白濃度，并將含有大部分lgG的級分匯集在一起。可以通過分光光度法或比色法完成。
5.此步驟后盡快進行綴合。
注意：對于結合較差或失敗的情況，降低DTT濃度可能會有所幫助。
四、進行綴合
1.每毫克IgG添加1.5毫克SMCC-APC。用鋁箔包裹反應管并在室溫下旋轉60分鐘。注意：這些摩爾比(每1gG約2個APC)效果很好。對于失敗或效果不佳的結合，不同的摩爾比可能會有所幫助。
2.60分鐘后，必須去掉lgG上未反應的游離巰基。
3.在1.0ml干DMSO中制備10mgNEM的新鮮溶液。
4.每毫克|gG添加34μg(3.4μl)。室溫下包裹并旋轉20分鐘。
2.60分鐘后，必須去掉lgG上未反應的游離巰基。
3.在1.0ml干DMSO中制備10mgNEM的新鮮溶液。
4.每毫克|gG添加34μg(3.4μl)。室溫下包裹并旋轉20分鐘。
