注：PE和APC的完整操作步驟及標(biāo)記方案在最后兩頁(yè)，如果不需要看介紹，可直接跳過(guò)
藻紅蛋白(R-PE及B-PE)
特點(diǎn)：
1.從紅藻中純化
2.具有高的發(fā)射量子產(chǎn)率
3.熒光團(tuán)與蛋白質(zhì)主鏈共價(jià)結(jié)合，不被淬滅
4.高水溶性
R-PE與B-PE的區(qū)別：
Wavelength(nm)
Wavelerngn(mm)
R-PE與B-PE的對(duì)比：
| R-PE | B-PE |
分子量 | 240,000 | 240,000 |
最大吸收 | 565 nm | 545 nm |
額外的吸收峰 | 498 nm | 564nm |
最大發(fā)射 | 573 nm | 573 nm |
消光系數(shù)(ε) | 1.96x106 M-1cm-1 | 2.41x106 M-1cm-1 |
熒光量子產(chǎn)率(QY) | 0.84 | 0.98 |
吸收比 | A566/A280≥5.0 A566/A498<1.5 A620/A566<0.01 | A545/A280≥5.5 A565/A496<2.7 A620/A545<0.01 |
特點(diǎn)：
1.從藍(lán)藻中純化
2.具有高的發(fā)射量子產(chǎn)率
3.熒光團(tuán)與蛋白質(zhì)主鏈共價(jià)結(jié)合，不被淬滅
4.高水溶性
APC和C-PC的區(qū)別：
APC和C-PC的對(duì)比：
| APC | C-PC |
分子量 | 104,000 | 264,000 |
最大吸收 | 651nm | 651nm |
最大發(fā)射 | 662nm | 647 nm |
消光系數(shù)(?) | 7.3x105 M-1cm-1 | 1.53x106cm-1M-1 |
熒光量子產(chǎn)率(QY) | 0.68 | 0.81 |
吸收比 | A650/A620≥1.25 A650/A280≥4.5 | A652/A620<0.3 A620/A280>4 |
交聯(lián)APC和APC的對(duì)比：
1.APC結(jié)構(gòu)：它具有α和β亞基，具有明顯的(αβ)3四級(jí)結(jié)構(gòu)。
2.為什么要將APC進(jìn)行交聯(lián)？答：交聯(lián)是為了防止APC在稀釋或暴露于變性鹽(如尿素或鹽酸胍)時(shí)發(fā)生可逆解離，從而保持其結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定。
3.如何進(jìn)行APC交聯(lián)？答：通過(guò)α和β亞基間的特異性交聯(lián)可以阻止APC的分解。
交聯(lián)比：>1.0
| NaClO4 | A650:A620 |
CL-APC | | 1.465849387 |
CL-APC+NaClO4 | + | 1.386850153/ |
| NaClO4 | A650:A620 |
APC | | 1.587272727 |
APC+NaClO4 | + | 0.317901235 |
注：圖中的紅色線條為沒(méi)有添加NaClO4，藍(lán)色線條為添加了NaClO4。
如圖及表中信息所示，CL-APC圖中添加NaClO4及沒(méi)添加NaClO4，吸收比沒(méi)有明顯變化。而在未交聯(lián)的APC中，添加NaClO4，得到的吸收比有非常大的變化，因?yàn)锳PC中加入了NaClO4導(dǎo)致了它出現(xiàn)了解離。
特點(diǎn)：
1.存在于大多數(shù)光合作用的甲藻中
2.高水溶性
3.大斯托克斯位移
光譜特性：
| PerCP |
分子量 | 35,000 |
最大吸收 | 483nm |
最大發(fā)射 | 676nm |
消光系數(shù)(ε) | 4.0x105 M-1cm-1 |
熒光量子產(chǎn)率(QY) | 1.0 |
亮度(exQY) | 4.9x105M-1cm-1 |
吸收比 | A482/A280>4.0 |
一、PE的制備
1.將PE純化。綴合前的濃度通常為5-10mg/ml。注意：PE在綴合前作為SAS(硫酸銨鈉)沉淀物穩(wěn)定。如果將PE以SAS沉淀物的形式儲(chǔ)存，則必須在使用前進(jìn)行大量純化。
2.使用3.5毫克R-PE修飾每毫克lgG，包括在緩沖液交換過(guò)程中損失的額外10%。
3.檢查PE的純度和濃度，請(qǐng)測(cè)量280、565和620nm處的吸光度。(1mg/ml的PE在565nm處的OD為8.2)。565/620比率>50表示已充分去除污染的藻藍(lán)蛋白；565/280比率> 5表示已充分去除所有其他蛋白質(zhì)。
二、PE的活化
1.使用前在無(wú)水DMSO中制備10mg/ml的SMCC儲(chǔ)備溶液。
2.每毫克PE加入11μlSMCC，并進(jìn)行渦旋。將反應(yīng)管用鋁箔包好，室溫下旋轉(zhuǎn)60分鐘。
3.將純化的PE過(guò)凝膠過(guò)濾柱來(lái)交換緩沖液。
注意：對(duì)于失敗或效果較差的結(jié)合，增加或減少SMCC相對(duì)于PE的量，可能會(huì)有所好轉(zhuǎn)。
三、1gG還原
1.在蒸餾水中制備1MDTT(15.4mg/100μl)的新鮮溶液。
2.1gG溶液濃度應(yīng)為4mg/ml或更高，這樣效果比較好。還原幾乎可以在任何緩沖液中進(jìn)行；MES、磷酸鹽和TRIS緩沖液(pH范圍為6至8)已被驗(yàn)證可以使用。如果抗體濃度低于2mg/ml，則應(yīng)濃縮。緩沖液交換柱上的損失應(yīng)額外增加10%。
3.用DTT配制20mMlgG溶液：每毫升IgG溶液加入20μlDTT原液并攪拌。室溫下靜置30分鐘無(wú)需額外攪拌(以盡量減少半胱an酸再氧化為胱an酸)。
4.將還原的lgG通過(guò)預(yù)平衡的“交換緩沖液"過(guò)濾柱。收集0.25毫升的級(jí)分，測(cè)定蛋白濃度，并將含有大部分lgG的級(jí)分匯集在一起。可以通過(guò)分光光度法或比色法完成。
5.此步驟后盡快進(jìn)行綴合。
注意：對(duì)于結(jié)合較差或失敗的情況，降低DTT濃度可能會(huì)有所幫助。
四、進(jìn)行綴合
1.每毫克IgG添加3.2毫克SMCC-PE。用鋁箔包裹反應(yīng)管并在室溫下旋轉(zhuǎn)60分鐘。注意：這些摩爾比(每IgG約2個(gè)PE)效果很好。對(duì)于失敗或效果不佳的結(jié)合，不同的摩爾比可能會(huì)有所幫助。
2.60分鐘后，必須去掉lgG上未反應(yīng)的游離巰基。
3.在1.0ml干DMSO中制備10mgNEM的新鮮溶液。
4.每毫克|gG添加34μg(3.4μl)。室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20分鐘。
2.60分鐘后，必須去掉lgG上未反應(yīng)的游離巰基。
3.在1.0ml干DMSO中制備10mgNEM的新鮮溶液。
4.每毫克|gG添加34μg(3.4μl)。室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20分鐘。
注1：整個(gè)綴合過(guò)程可以在一天內(nèi)完成。但是，綴合前對(duì)APC的純化可能需要24-48小時(shí)。除了下面列出的材料外，您還需要濃度至少為2mg/ml的抗體溶液。請(qǐng)您在進(jìn)行APC抗體綴合實(shí)驗(yàn)之前熟悉如何使用脫鹽柱以及如何獲取吸光度光譜。
注2：SMCC-APC綴合物非常穩(wěn)定(在“交換緩沖液"中，在4C下至少可以穩(wěn)定幾個(gè)月)。因此，如果您需要節(jié)省一部分時(shí)間，可以選擇同時(shí)綴合10毫克或更多的APC，并將其用于幾次抗體實(shí)驗(yàn)(在幾周內(nèi))。SMCC-APC的長(zhǎng)期儲(chǔ)存最好是作為飽和硫酸銨沉淀物。
一、APC的制備
1.將APC純化。綴合前的濃度通常為5-10mg/ml。注意：APC在綴合前作為SAS(硫酸銨鈉)沉淀物穩(wěn)定。如果將APC以SAS沉淀物的形式儲(chǔ)存，則必須在使用前進(jìn)行大量純化。在用每毫升1升的“透析緩沖液"透析之前，用每毫升1升APC的PBS進(jìn)行透析2次。
2.使用1.7毫克APC修飾每毫克lgG，包括在緩沖液交換過(guò)程中損失的額外10%。
3.檢查APC的純度和濃度，請(qǐng)測(cè)量280、620和655nm處的吸光度。(1mg/ml的APC在655nm處的OD為5.9)。655/620比率>1.4表明雜質(zhì)被充分去除；655/280比率>4表明所有其他蛋白質(zhì)均已充分去除
二、APC的活化
1.使用前在無(wú)水DMSO中制備10mg/ml的SMCC儲(chǔ)備溶液。
2.每毫克APC加6μlSMCC，并進(jìn)行渦旋。將反應(yīng)管用鋁箔包好，室溫下旋轉(zhuǎn)60分鐘。
3.將純化的APC過(guò)凝膠過(guò)濾柱來(lái)交換緩沖液。
注意：對(duì)于失敗或效果較差的結(jié)合，增加或減少SMCC相對(duì)于APC的量，可能會(huì)有所好轉(zhuǎn)。
三、1gG還原
1.在蒸餾水中制備1MDTT(15.4mg/100μl)的新鮮溶液。
2.1gG溶液濃度應(yīng)為4mg/ml或更高，這樣效果比較好。還原幾乎可以在任何緩沖液中進(jìn)行；MES、磷酸鹽和TRIS緩沖液(pH范圍為6至8)已被驗(yàn)證可以使用。如果抗體濃度低于2mg/ml，則應(yīng)濃縮。緩沖液交換柱上的損失應(yīng)額外增加10%。
3.用DTT配制20mMlgG溶液：每毫升IgG溶液加入20μlDTT原液并攪拌。室溫下靜置30分鐘，無(wú)需額外攪拌(以盡量減少半胱an酸再氧化為胱an酸)。
4.將還原的lgG通過(guò)預(yù)平衡的“交換緩沖液"過(guò)濾柱。收集0.25毫升的級(jí)分，測(cè)定蛋白濃度，并將含有大部分lgG的級(jí)分匯集在一起?？梢酝ㄟ^(guò)分光光度法或比色法完成。
5.此步驟后盡快進(jìn)行綴合。
注意：對(duì)于結(jié)合較差或失敗的情況，降低DTT濃度可能會(huì)有所幫助。
四、進(jìn)行綴合
1.每毫克IgG添加1.5毫克SMCC-APC。用鋁箔包裹反應(yīng)管并在室溫下旋轉(zhuǎn)60分鐘。注意：這些摩爾比(每1gG約2個(gè)APC)效果很好。對(duì)于失敗或效果不佳的結(jié)合，不同的摩爾比可能會(huì)有所幫助。
2.60分鐘后，必須去掉lgG上未反應(yīng)的游離巰基。
3.在1.0ml干DMSO中制備10mgNEM的新鮮溶液。
4.每毫克|gG添加34μg(3.4μl)。室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20分鐘。
2.60分鐘后，必須去掉lgG上未反應(yīng)的游離巰基。
3.在1.0ml干DMSO中制備10mgNEM的新鮮溶液。
4.每毫克|gG添加34μg(3.4μl)。室溫下包裹并旋轉(zhuǎn)20分鐘。
