XFD660 馬來(lái)酰亞胺是硫醇反應(yīng)性染料，用于標(biāo)記巰基，。XFD660 適合高級(jí)成像和流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用。在pH 4-10范圍內(nèi)熒光不受影響且光穩(wěn)定性好。XFD660 的馬來(lái)酰亞胺衍生物通常用于與蛋白質(zhì)、寡核苷酸或低分子量配體上的硫醇基團(tuán)結(jié)合，產(chǎn)生的結(jié)合物與其他光譜相似的熒光團(tuán)相比，熒光亮度明顯更高，光穩(wěn)定性更強(qiáng)。
馬來(lái)酰亞胺在中性條件下很容易與蛋白質(zhì)、經(jīng)巰基修飾的寡核苷酸和其他含巰基分子中的巰基發(fā)生反應(yīng)。所得的染料偶聯(lián)物相當(dāng)穩(wěn)定。
AF660馬來(lái)酰亞胺適用范圍
標(biāo)記抗體、蛋白質(zhì)、硫醇修飾的寡核苷酸
AF660馬來(lái)酰亞胺實(shí)驗(yàn)方案
溶液配制
除非另有說(shuō)明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性等分，并在配制后儲(chǔ)存在-20°C下。避免反復(fù)凍融。
1.蛋白質(zhì)儲(chǔ)備溶液（溶液A）
將100µL反應(yīng)緩沖液(例如pH~6.0的100mM MES緩沖液)與900µL蛋白溶液(例如抗體，蛋白質(zhì)濃度>2 mg/mL)混合，制成1mL蛋白質(zhì)標(biāo)記儲(chǔ)備溶液。
注意：蛋白質(zhì)溶液(溶液A)的pH值應(yīng)為6.5±0.5。
注意：不純的抗體或用牛血清白蛋白(BSA)或其他蛋白穩(wěn)定的抗體不能很好地被標(biāo)記
注意：蛋白質(zhì)濃度低于2mg/mL，偶聯(lián)效率會(huì)顯著降低。為了獲得好的標(biāo)記效率，建議最終蛋白質(zhì)濃度范圍為2-10mg/mL。
2.染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）
將無(wú)水DMSO加入XFD660 馬來(lái)酰亞胺小瓶中，制成10mM儲(chǔ)備溶液。通過(guò)移液或渦旋混合均勻。
注意：開(kāi)始偶聯(lián)之前準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液(溶液B)并及時(shí)使用。染料儲(chǔ)備溶液長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存可能會(huì)降低染料活性。溶液B在避光和防潮的情況下可以在冰箱中儲(chǔ)存4周。避免反復(fù)凍融。
3.可選
DTT 或 TCEP 將二硫鍵轉(zhuǎn)化為兩個(gè)游離硫醇基團(tuán)。如果使用 DTT，則必須在馬來(lái)酰亞胺染料與蛋白質(zhì)結(jié)合之前，通過(guò)透析或凝膠過(guò)濾除去游離 DTT。以下是生成游離硫醇基團(tuán)的示例方案：
1.在蒸餾水中制備 1M DTT (15.4 mg/100 µL) 的新鮮溶液。
2.在 20 mM DTT 中制備 IgG 溶液：混合時(shí)每 ml IgG 溶液添加 20 µL DTT儲(chǔ)備液。在室溫下靜置 30 分鐘，無(wú)需額外混合
3.將還原的 IgG 通過(guò)用“交換緩沖液”預(yù)平衡的過(guò)濾柱。從柱中收集 0.25 mL 餾分。
4.確定蛋白質(zhì)濃度并將大部分 IgG 的組分合并。可以通過(guò)分光光度法或比色法來(lái)完成。
此步驟后盡快進(jìn)行綴合(參見(jiàn)示例實(shí)驗(yàn)方案)。
注意： 為了獲得好的結(jié)果，IgG 溶液得濃度應(yīng) >4 mg/mL。如果抗體低于 2 mg/mL，則應(yīng)進(jìn)行濃縮。另外，需要增加 10% 來(lái)補(bǔ)償在緩沖液交換柱上的損失。
注意：還原反應(yīng)可以在 pH 7-7.5 的任何緩沖液中進(jìn)行，例如 MES、磷酸鹽或 TRIS 緩沖液。
注意：步驟3和4可以用透析代替。
樣品實(shí)驗(yàn)方案
(該方案適用于山羊抗小鼠IgG與XFD 660 馬來(lái)酰亞胺的偶聯(lián)物標(biāo)記。)
注意：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比，這也取決于染料的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的過(guò)度標(biāo)記可能會(huì)對(duì)其結(jié)合親和力產(chǎn)生不利影響，而低染料/蛋白質(zhì)比的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物會(huì)降低靈敏度。
進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)
1.使用10:1的摩爾比率(溶液B(染料)/A(蛋白質(zhì)))作為起點(diǎn)：將5µL染料儲(chǔ)備溶液(溶液B，假設(shè)染料儲(chǔ)備溶液為10 mM)加入蛋白質(zhì)溶液(95µL溶液A)的小瓶中并充分搖晃。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為10mg/mL，蛋白質(zhì)分子量為~200KD，則蛋白質(zhì)濃度為~0.05 mM。
注意：建議使用溶液B(染料)/溶液A(蛋白質(zhì))的摩爾比為10:1。如果太少或太高，可以嘗試5:1、15:1和20:1來(lái)確定合適的染料/蛋白質(zhì)比。
2.在室溫下繼續(xù)旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)反應(yīng)混合物30-60分鐘。
純化偶聯(lián)
(以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料蛋白偶聯(lián)物的一個(gè)例子)
1.按照產(chǎn)品說(shuō)明準(zhǔn)備Sephadex G-25柱。
2.將“進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)”步驟中的反應(yīng)混合物裝入Sephadex G-25柱的頂部。
3.當(dāng)樣品剛低于頂部樹(shù)脂表面時(shí)，立即加入PBS(pH 7.2-7.4.)。
4.向樣品中加入更多的PBS(pH 7.2-7.4)完成柱子純化。將含有目標(biāo)染料-蛋白質(zhì)綴合物的組分合并。
注意：如果需要立即使用，染料-蛋白質(zhì)綴合物物需要用染色緩沖液稀釋?zhuān)⒎盅b。
注意：為了長(zhǎng)期儲(chǔ)存，染料蛋白綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥。
表征所需的染料-蛋白質(zhì)綴合物
取代度 (DOS) 是表征染料標(biāo)記蛋白質(zhì)的關(guān)鍵因素。 DOS 較低的蛋白質(zhì)通常熒光強(qiáng)度較弱，而 DOS 較高的蛋白質(zhì)也可能熒光強(qiáng)度減弱。對(duì)于大多數(shù)抗體，建議最佳 DOS 在 2 到 10 之間，具體取決于染料和蛋白質(zhì)的特性。為了有效標(biāo)記，DOS 應(yīng)控制為每摩爾抗體含有 5-8 摩爾 XFD660 馬來(lái)酰亞胺。以下步驟概述了如何確定 XFD660 馬來(lái)酰亞胺標(biāo)記蛋白的 DOS。
檢測(cè)吸收率
要測(cè)量染料-蛋白質(zhì)綴合物的吸收光譜，請(qǐng)將樣品濃度保持在 1 至 10 µM 之間。該范圍內(nèi)的確切濃度取決于染料的消光系數(shù)。
在 280 nm 處讀取 OD（吸光度）和染料最大吸光度（對(duì)于 XFD660 染料，?max = 663 nm）
對(duì)于大多數(shù)分光光度計(jì)，用去離子水稀釋樣品(來(lái)自柱餾分)，直到 OD 值落在 0.1 至 0.9 的范圍內(nèi)。蛋白質(zhì)的最佳吸光度為 280 nm，而 XFD660 馬來(lái)酰亞胺的最佳吸光度為 663 nm。為了確保讀數(shù)準(zhǔn)確，請(qǐng)確保結(jié)合物不含任何非結(jié)合染料。
