XFD660 馬來酰亞胺是硫醇反應性染料，用于標記巰基，。XFD660 適合高級成像和流式細胞術應用。在pH 4-10范圍內熒光不受影響且光穩(wěn)定性好。XFD660 的馬來酰亞胺衍生物通常用于與蛋白質、寡核苷酸或低分子量配體上的硫醇基團結合，產生的結合物與其他光譜相似的熒光團相比，熒光亮度明顯更高，光穩(wěn)定性更強。
馬來酰亞胺在中性條件下很容易與蛋白質、經巰基修飾的寡核苷酸和其他含巰基分子中的巰基發(fā)生反應。所得的染料偶聯物相當穩(wěn)定。
AF660馬來酰亞胺適用范圍
標記抗體、蛋白質、硫醇修飾的寡核苷酸
AF660馬來酰亞胺實驗方案
溶液配制
除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分為一次性等分，并在配制后儲存在-20°C下。避免反復凍融。
1.蛋白質儲備溶液（溶液A）
將100µL反應緩沖液(例如pH~6.0的100mM MES緩沖液)與900µL蛋白溶液(例如抗體，蛋白質濃度>2 mg/mL)混合，制成1mL蛋白質標記儲備溶液。
注意：蛋白質溶液(溶液A)的pH值應為6.5±0.5。
注意：不純的抗體或用牛血清白蛋白(BSA)或其他蛋白穩(wěn)定的抗體不能很好地被標記
注意：蛋白質濃度低于2mg/mL，偶聯效率會顯著降低。為了獲得好的標記效率，建議最終蛋白質濃度范圍為2-10mg/mL。
2.染料儲備溶液（溶液B）
將無水DMSO加入XFD660 馬來酰亞胺小瓶中，制成10mM儲備溶液。通過移液或渦旋混合均勻。
注意：開始偶聯之前準備染料儲備溶液(溶液B)并及時使用。染料儲備溶液長時間儲存可能會降低染料活性。溶液B在避光和防潮的情況下可以在冰箱中儲存4周。避免反復凍融。
3.可選
DTT 或 TCEP 將二硫鍵轉化為兩個游離硫醇基團。如果使用 DTT，則必須在馬來酰亞胺染料與蛋白質結合之前，通過透析或凝膠過濾除去游離 DTT。以下是生成游離硫醇基團的示例方案：
1.在蒸餾水中制備 1M DTT (15.4 mg/100 µL) 的新鮮溶液。
2.在 20 mM DTT 中制備 IgG 溶液：混合時每 ml IgG 溶液添加 20 µL DTT儲備液。在室溫下靜置 30 分鐘，無需額外混合
3.將還原的 IgG 通過用“交換緩沖液”預平衡的過濾柱。從柱中收集 0.25 mL 餾分。
4.確定蛋白質濃度并將大部分 IgG 的組分合并?？梢酝ㄟ^分光光度法或比色法來完成。
此步驟后盡快進行綴合(參見示例實驗方案)。
注意： 為了獲得好的結果，IgG 溶液得濃度應 >4 mg/mL。如果抗體低于 2 mg/mL，則應進行濃縮。另外，需要增加 10% 來補償在緩沖液交換柱上的損失。
注意：還原反應可以在 pH 7-7.5 的任何緩沖液中進行，例如 MES、磷酸鹽或 TRIS 緩沖液。
注意：步驟3和4可以用透析代替。
樣品實驗方案
(該方案適用于山羊抗小鼠IgG與XFD 660 馬來酰亞胺的偶聯物標記。)
注意：每種蛋白質都需要不同的染料/蛋白質比，這也取決于染料的性質。蛋白質的過度標記可能會對其結合親和力產生不利影響，而低染料/蛋白質比的蛋白質偶聯物會降低靈敏度。
進行偶聯反應
1.使用10:1的摩爾比率(溶液B(染料)/A(蛋白質))作為起點：將5µL染料儲備溶液(溶液B，假設染料儲備溶液為10 mM)加入蛋白質溶液(95µL溶液A)的小瓶中并充分搖晃。假設蛋白質濃度為10mg/mL，蛋白質分子量為~200KD，則蛋白質濃度為~0.05 mM。
注意：建議使用溶液B(染料)/溶液A(蛋白質)的摩爾比為10:1。如果太少或太高，可以嘗試5:1、15:1和20:1來確定合適的染料/蛋白質比。
2.在室溫下繼續(xù)旋轉或搖動反應混合物30-60分鐘。
純化偶聯
(以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料蛋白偶聯物的一個例子)
1.按照產品說明準備Sephadex G-25柱。
2.將“進行偶聯反應”步驟中的反應混合物裝入Sephadex G-25柱的頂部。
3.當樣品剛低于頂部樹脂表面時，立即加入PBS(pH 7.2-7.4.)。
4.向樣品中加入更多的PBS(pH 7.2-7.4)完成柱子純化。將含有目標染料-蛋白質綴合物的組分合并。
注意：如果需要立即使用，染料-蛋白質綴合物物需要用染色緩沖液稀釋，并分裝。
注意：為了長期儲存，染料蛋白綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥。
表征所需的染料-蛋白質綴合物
取代度 (DOS) 是表征染料標記蛋白質的關鍵因素。 DOS 較低的蛋白質通常熒光強度較弱，而 DOS 較高的蛋白質也可能熒光強度減弱。對于大多數抗體，建議最佳 DOS 在 2 到 10 之間，具體取決于染料和蛋白質的特性。為了有效標記，DOS 應控制為每摩爾抗體含有 5-8 摩爾 XFD660 馬來酰亞胺。以下步驟概述了如何確定 XFD660 馬來酰亞胺標記蛋白的 DOS。
檢測吸收率
要測量染料-蛋白質綴合物的吸收光譜，請將樣品濃度保持在 1 至 10 µM 之間。該范圍內的確切濃度取決于染料的消光系數。
在 280 nm 處讀取 OD（吸光度）和染料最大吸光度（對于 XFD660 染料，?max = 663 nm）
對于大多數分光光度計，用去離子水稀釋樣品(來自柱餾分)，直到 OD 值落在 0.1 至 0.9 的范圍內。蛋白質的最佳吸光度為 280 nm，而 XFD660 馬來酰亞胺的最佳吸光度為 663 nm。為了確保讀數準確，請確保結合物不含任何非結合染料。
