用Amplite Red測定過氧化物酶（HRP）的方案（用于96孔板）

概述

在磷酸鹽緩沖液（50μL）中加入200μMH2O2制備1X Amplite Red工作溶液

加入過氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)品或測試樣品（50μL）

在室溫下孵育10-30分鐘

在Ex / Em = 540/590 nm處監(jiān)測熒光強(qiáng)度

注意：以下是溶液中過氧化物酶測定的推薦方案。 該說明書僅提供指導(dǎo)，實(shí)際應(yīng)根據(jù)具體需要進(jìn)行修改。

操作方法

A1.準(zhǔn)備Amplite Red過氧化物酶工作溶液：

1.1Prepare 250X Amplite Red原液：將200μL無水DMSO加入小瓶中，充分混合。 應(yīng)立即使用原液。 任何未使用的溶液需要等分并在<-20℃重新冷凍。

注意：避免反復(fù)凍融循環(huán)，避免光照。

1.2制備1X Amplite 紅色過氧化物酶工作溶液：在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將Amplite Red固體溶解在DMSO中或在室溫下解凍等份的Amplite Red儲備溶液。通過將20μL250XAmplite Red儲備溶液（來自步驟1.1）加入5mL 50mM磷酸鹽緩沖液或所選緩沖液（pH7）和200μMH2O2中，制備1X工作溶液。

注意：在硫醇如DTT和β-巰基乙醇存在下，Amplite Red不穩(wěn)定。 高于10μM（終濃度）的硫醇可顯著降低測定動態(tài)范圍。NADH和谷胱G肽（從GSH中還原）可能會干擾測定。

A2.在上清液中運(yùn)行過氧化物酶測定：

2.1將50μL的1X Amplite 紅色過氧化物酶工作溶液（來自步驟1.2）加入過氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照和測試樣品的每個孔中，使總過氧化物酶測定體積為100μL/孔。

注意：對于384孔板，在每個孔中加入25μL樣品和25μL1XAmplite 紅色過氧化物酶工作溶液。

2.2在室溫下孵育反應(yīng)10至30分鐘，避光。

2.3使用熒光板讀數(shù)器監(jiān)測Ex / Em = 540/590 nm處的熒光增加。

2.4空白孔中的熒光（僅含測定緩沖液）用作對照，并從具有過氧化物酶反應(yīng)的那些孔的值中減去。

使用Amplite Red測定H2O2的測定方案（一個96孔板）

概述

在磷酸鹽緩沖液（50μL）中制備含有0.4 U / mL過氧化物酶的1X Amplite 紅色H2O2工作溶液

添加H2O2標(biāo)準(zhǔn)品或測試樣品（50μL）

在室溫下孵育10-30分鐘

監(jiān)測Ex / Em = 540 / 590nm處的熒光強(qiáng)度

注意：以下是溶液中H2O2測定的推薦方案。 該說明書僅提供指導(dǎo)，實(shí)際應(yīng)根據(jù)具體需要進(jìn)行修改。

操作方法

B1.準(zhǔn)備Amplite 紅色H2O2工作溶液：

1.1Prepare 250X Amplite Red原液：將200μL無水DMSO加入小瓶中，充分混合。原液應(yīng)立即使用不可存放過久。任何未使用的溶液需要等分并在<-20℃重新冷凍。

注意：避免反復(fù)凍融循環(huán)，避免光照。

1.2制備1X Amplite 紅色H2O2工作溶液：在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將Amplite Red固體溶于DMSO中或在室溫下解凍等份的Amplite Red原液。通過將20μL250X儲備溶液（來自步驟1）加入5mL 50mM磷酸鹽緩沖液或所選緩沖液（pH7）和0.4單位/ mL過氧化物酶中，制備1X工作溶液。

注意：在硫醇如DTT和β-巰基乙醇存在下，Amplite Red不穩(wěn)定。 高于10μM（終濃度）的硫醇可顯著降低測定動態(tài)范圍。NADH和谷胱G肽（從GSH中還原）可能會干擾測定。

B2.在上清液中進(jìn)行H2O2測定：

2.1將50μL1XAmplite Red H2O2工作溶液（來自步驟1.2）加入H2O2標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照和測試樣品的每個孔中，使總H2O2測定體積為100μL/孔。

注意：對于384孔板，在每個孔中加入25μL樣品和25μL1XAmplite Red H2O2工作溶液。

2.2在室溫下孵育反應(yīng)10至30分鐘，避光。

2.3使用熒光板讀數(shù)器監(jiān)測Ex / Em = 540/590 nm處的熒光增加。

空白孔中的熒光（僅使用測定緩沖液）用作對照，并從具有H2O2反應(yīng)的那些孔的值中減去。