96孔板測定示例

概述

制備D-乳酸測定混合物（50μL）

加入D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品或測試樣品（50μL）

在室溫下孵育30分鐘~2小時

監(jiān)測吸光度比率在A575nm / A605nm處增加

注意：在開始實驗之前，在室溫下解凍每個試劑盒組分的一個小瓶。

操作方法

1.準(zhǔn)備NAD儲備溶液（100X）：

向NAD小瓶（組分C）中加入100μLH2O，制成100X NAD儲備溶液。

2.準(zhǔn)備D-乳酸儲備液：

將200μLH2 O或1×PBS緩沖液加入到D-乳酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品（組分D）的小瓶中以制備100mM D-乳酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液。

注意：未使用的D-lacate標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

3.準(zhǔn)備D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品（0至1 mM）的連續(xù)稀釋液：

3.1將10μLD-乳酸儲備溶液（來自步驟2）加入990L 1x PBS緩沖液中以產(chǎn)生1mM D-乳酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液。

注意：稀釋的D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時內(nèi)使用。

3.2取200μL的1mM D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行1：3連續(xù)稀釋，得到300,100,30,10,3,1和0μM的D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋液。

3.3如說明書中的表1和2中所述，將含有D-乳酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品和含D-乳酸鹽的測試樣品的系列稀釋液加入白色透明底96孔微量培養(yǎng)板中。

4.準(zhǔn)備D-乳酸測定混合物：

4.1將5 mL測定緩沖液（組分B）加入一瓶酶混合物（組分A）中。

4.2將50μLNAD儲備液（100X，來自步驟1）加入組分A（來自步驟4.1）的瓶中，并且混合均勻。

注意：這種D-乳酸測定混合物足以用于一個96孔板。 未使用的D-乳酸測定混合物應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

5.運(yùn)行D-乳酸測定：

5.1將50μLD-乳酸測定混合物（來自步驟4.2）添加到D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照和測試樣品（參見步驟3.3）的每個孔中，以使總D-乳酸測定體積為100μL/孔。

注意：對于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μLD-乳酸測定混合物。

5.2在室溫下孵育反應(yīng)30分鐘至2小時，避光。

5.3用A575nm / A605nm的吸光度讀板儀檢測吸光度比率的增加。