Amplite NAD/NADH比率檢測試劑盒（熒光法）紅色熒光是美國AAT Bioquest研發(fā)的檢測NAD/NADH的試劑盒，煙*胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和煙*胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是細胞中發(fā)現的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通過酯鍵將磷酸基團添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代謝生物反應，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作為還原劑。 在葉綠體中，NADP是在光合作用的初步反應中重要的氧化劑。 通過光合作用產生的NADPH用作卡爾文光合作用循環(huán)中生物合成反應的還原能力。 傳統的NAD / NADH和NADP / NADPH測定通過監(jiān)測340nm處NADH或NADPH吸收的變化來完成。 該方法具有低靈敏度和高干擾，因為該測定在需要昂貴的石英微孔板的UV范圍內進行。

這種Amplite 熒光NAD / NADH比率分析試劑盒為敏感檢測NAD，NADH及其比例提供了一種便捷的方法。 系統中的酶特異性識別酶循環(huán)反應中的NAD / NADH，其顯著提高了檢測靈敏度。 此外，該測定具有非常低的背景，因為其在紅色可見范圍內運行，這顯著降低了來自生物樣品的干擾。 無需從樣品混合物中純化NAD / NADH。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進行測定。 其信號可以通過熒光酶標儀在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm（大Ex / Em = 540/590nm）或吸光度酶標儀在~576nm處容易地讀取。 該試劑盒提供NAD和NADH提取緩沖液，以及細胞裂解緩沖液，方便您使用。 它經常用于從細胞裂解物中測定NAD / NADH。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優(yōu)質的Amplite NAD/NADH比率檢測試劑盒（熒光法）。

實驗方案

96孔板測定示例

概述

準備25μLNADH標準品和/或測試樣品

添加25μLNADH或NAD提取溶液

在室溫下孵育15分鐘

加入25μLNAD或NADH萃取溶液

加入75μLNAD/ NADH反應混合物

在室溫下孵育15分鐘至2小時

監(jiān)測Ex / Em = 540 / 590nm處的熒光強度

注意：在開始實驗之前，在室溫下解凍每個試劑盒組分中的一個。

操作方法

1.準備NADH儲備溶液：

將200μLPBS緩沖液加入到NADH標準品（組分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADH儲備溶液。

注意：未使用的NADH儲備溶液應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

2.準備NAD / NADH反應混合物：

將10mL NADH傳感器緩沖液（組分B）加入NAD / NADH再循環(huán)酶混合物（組分A）的瓶中，并充分混合。

注意：這種NAD / NADH反應混合物足以用于兩個96孔板。 未使用的NAD / NADH反應混合物應分成一次性等分試樣并儲存在-20℃。

3.準備連續(xù)稀釋的NADH標準品（0至10μM）：

3.1將30μL1mMNADH儲備溶液（來自步驟1）加入970μLPBS緩沖液（pH7.4）中，得到30μM（30pmol / L）NADH標準溶液。

注意：稀釋的NADH標準溶液不穩(wěn)定，應在4小時內使用。

3.2取200μL30M NADH標準溶液（來自步驟3.1）進行1：3連續(xù)稀釋，得到10,3,1,0.3,0.1,0.03和0 M系列稀釋的NADH標準品。

3.3如表1和2中所述，將連續(xù)稀釋的NADH標準品和/或含NAD / NADH的測試樣品添加到固體黑色96孔微量培養(yǎng)板中。

注意：根據需要準備細胞或組織樣本。

表1.實心黑色96孔微孔板中NADH標準品和測試樣品的布局

注意：NS = NAD / NADH標準; BL =空白對照; TS =測試樣品; TS（NADH）=用NADH萃取溶液處理10至15分鐘的測試樣品，然后用NAD萃取溶液中和; TS（NAD）=用NAD提取溶液處理10至15分鐘的測試樣品，然后用NADH提取溶液中和。

表2每個孔的試劑組成

*注意：將連續(xù)稀釋的NADH標準品從0.03μM至30μM加入NS1至NS7的孔中，一式兩份。 高濃度的NADH（例如，>300μM，終濃度）可能由于NADH傳感器（非熒光產物）的過度氧化而導致熒光信號降低。

3.4對于NADH提取（NADH）：將25μLNADH提取溶液（組分D）加入含有NAD / NADH的測試樣品的孔中。 在室溫下孵育10至15分鐘，然后加入25μLNAD提取溶液（組分E）以中和NADH提取物，如表1和2中所述。

對于NAD提取（NAD）：將25μLNAD提取溶液（組分E）加入含有NAD / NADH的測試樣品的孔中。 在室溫下孵育10至15分鐘，然后加入25μLNADH提取溶液（組分D）以中和NAD提取物，如表1和2中所述。

對于總NAD和NADH：將25μLNAD/ NADH對照溶液（組分F）加入NADH標準品和含有NAD / NADH的測試樣品的孔中。 在室溫下孵育10至15分鐘，然后如表1和2中所述添加25μL對照溶液（組分F）。

注意1：根據需要準備細胞或組織樣本。 NAD / NADH裂解緩沖液（組分G）可用于裂解細胞（詳見附錄）。

注意2：在健康的哺乳動物細胞中，與NADH相比，NAD更多，因此可以簡單地使用總NAD和NADH減去NAD來計算NADH的量。

4.在上清液反應中運行NAD / NADH測定：

4.1將75μLNADH反應混合物（來自步驟2）加入NADH標準品，空白對照和測試樣品（來自步驟3.4）的每個孔中，使得總NADH測定體積為150μL/孔。

4.2在室溫下孵育反應15分鐘至2小時，避光。

4.3用Ex / Em = 540 / 590nm（截止值570nm）的熒光板讀數器監(jiān)測熒光增加。

注意：也可以將板的內容物轉移到白色透明底板上，并用吸光度酶標儀在576±5nm的波長下讀數。 與熒光讀數相比，吸收檢測具有較低的靈敏度。