Amplite NAD檢測(cè)試劑盒 （熒光法）藍(lán)色熒光是美國(guó)AAT Bioquest研發(fā)的檢測(cè)NAD的試劑盒，煙X胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）及其氧化形式（NAD）是活細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的許多酶反應(yīng)的必需輔助因子。 量化這些因子的產(chǎn)生或消耗是監(jiān)測(cè)酶介導(dǎo)的反應(yīng)或篩選這些酶反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑或底物的重要方法。 市場(chǎng)上有幾種用于量化NADH或總NAD / NADH量的試劑盒，但是迄今為止在大量過(guò)量NADH存在下檢測(cè)NAD是非常具有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)镹AD在259 nm處具有其吸收峰且不發(fā)熒光， 使測(cè)量不實(shí)用。

Amplite 熒光NAD分析試劑盒可便捷，快速地檢測(cè)NAD。 該試劑盒使用我們新開(kāi)發(fā)的NAD傳感器Quest Fluor NAD試劑直接測(cè)量NAD。 該試劑盒中使用的專(zhuān)有探針僅與NAD反應(yīng)產(chǎn)生在Ex / Em = 420 / 480nm處熒光的產(chǎn)物，并且對(duì)NADH幾乎沒(méi)有響應(yīng)。 該試劑盒可在100μL測(cè)定體積中檢測(cè)少至30 nM的NAD，并在過(guò)量的NADH存在下監(jiān)測(cè)0.3％的NAD產(chǎn)生。 該測(cè)定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進(jìn)行，并且可以用于高通量篩選。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite NAD檢測(cè)試劑盒 （熒光法）藍(lán)色熒光。

實(shí)驗(yàn)方案

96孔板檢測(cè)示例

概述

準(zhǔn)備N(xiāo)AD標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品（50μL）

添加20μLQuestFluor NAD探針添加20μL

測(cè)定溶液在室溫下孵育10-20分鐘

添加15μL增強(qiáng)劑溶液

在室溫下孵育10-20分鐘

監(jiān)測(cè)420/480 nm的熒光

注意：在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，在室溫下解凍每個(gè)試劑盒組分。

操作步驟

1.準(zhǔn)備N(xiāo)AD庫(kù)存解決方案：

將500μlddH2 O加入到NAD標(biāo)準(zhǔn)品（組分D）的小瓶中以制備1mM NAD儲(chǔ)備溶液。

注意：未使用的NAD儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-20 ℃。

2.準(zhǔn)備N(xiāo)AD標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋液（0至10μM）：

2.1將10μLNAD儲(chǔ)備溶液（來(lái)自步驟1）加入990L H2O或PBS緩沖液中以產(chǎn)生10M NAD標(biāo)準(zhǔn)溶液。

注意：稀釋的NAD標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。

2.2取200μL10μMNAD標(biāo)準(zhǔn)溶液，在H2O或PBS中進(jìn)行1：3連續(xù)稀釋?zhuān)玫絅AD標(biāo)準(zhǔn)品的10,3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM連續(xù)稀釋液。

2.3如表1所述，將50μL系列稀釋的NAD標(biāo)準(zhǔn)品和含有NAD的測(cè)試樣品加入黑色/固體底96孔微孔板中：

表1在黑色/固體底96孔微孔板中的NAD標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品的布局

注1：NS = NAD標(biāo)準(zhǔn)，BL =空白對(duì)照，TS =測(cè)試樣品。

注2：將連續(xù)稀釋的NAD標(biāo)準(zhǔn)品從10μM加到0.01μM加入NS1至NS7的孔中，一式兩份。

3.運(yùn)行NAD測(cè)定：

3.1將20μLQuestFluor NAD探針（組分A）溶液加入NAD標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照品和測(cè)試樣品的每個(gè)孔中，充分混合。

3.2將20μL測(cè)定溶液（組分B）加入每個(gè)孔中，充分混合。

注意：對(duì)于384孔板，每孔加入25μL樣品和10μLQuestFluor™NAD Probe和10μLAssaySolution。

3.3在室溫下孵育反應(yīng)10-20分鐘，避光。

3.4向每個(gè)孔中加入15μL增強(qiáng)劑（組分C），使總NAD測(cè)定體積為105μL/孔，并在室溫下孵育10-20分鐘，避光。

注意：對(duì)于384孔板，添加7.5 uL增強(qiáng)劑。

3.5使用熒光板讀數(shù)器在420/480 nm處檢測(cè)熒光增加。