樣品實(shí)驗(yàn)方案

溶液配制

儲備溶液配制

cAMP標(biāo)準(zhǔn)（1mM）：將100 µL稀釋劑（組分E）添加到cAMP標(biāo)準(zhǔn)品（組分C）中，并充分混合。 注意：未使用的cAMP標(biāo)準(zhǔn)液可以等分并保存在-20℃下。

工作溶液配制

1. Anti cAMP-trFluor Eu工作溶液：將55 µL（#36379）或550 µL（#36380或＃36381）稀釋劑（組分E）添加到Anti cAMP-trFluor Eu（組分A）小瓶中。 將50 µL重構(gòu)溶液添加到2.5 mL細(xì)胞裂解緩沖液（組分D）中。

2. cAMP-trFluor 650工作溶液：在cAMP-trFluor 650小瓶（組分B）中加入55 µL（#36379）或550 µL（#36380或＃36381）稀釋劑（組分E）。 將50 µL重構(gòu)溶液添加到2.5 mL細(xì)胞裂解緩沖液（組分D）中。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.細(xì)胞制備：

1.1對于貼壁細(xì)胞：將細(xì)胞在生長培養(yǎng)基中以30,000-100,000個細(xì)胞/孔在96孔板中過夜培養(yǎng)。

1.2對于非貼壁細(xì)胞：從培養(yǎng)基中離心細(xì)胞，然后將細(xì)胞沉淀以100,000-300,000個細(xì)胞/孔的速率懸浮在培養(yǎng)基中，在96孔板中培養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)前，將板以800 rpm的速度離心2分鐘。

1.3根據(jù)需要處理細(xì)胞：以下是用Forskolin處理的Hela細(xì)胞在96孔板中誘導(dǎo)cAMP的示例。 在生長培養(yǎng)基中添加25 µL細(xì)胞，在Hanks中加入25 µL /孔的100 µM Forskolin和20 mM Hepes緩沖液（HHBS），在5％CO2、37℃恒溫箱中孵育15分鐘。 注意：應(yīng)單獨(dú)評估每個細(xì)胞系，以確定細(xì)胞密度。 細(xì)胞可以在實(shí)驗(yàn)的前或?qū)嶒?yàn)當(dāng)天接種，具體取決于細(xì)胞類型和/或受試化合物的作用。

表1.黑色96孔板中cAMP標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品的布局。 CS = cAMP標(biāo)準(zhǔn)（CS1-CS7）; BL =空白對照； TS =測試樣品。

表2.每個孔的試劑組成。

2.細(xì)胞裂解物中的cAMP測定

2.1根據(jù)表1和表2提供的布局，準(zhǔn)備并添加cAMP標(biāo)準(zhǔn)品（CS），空白對照（BL）和測試樣品（TS）。對于384孔板，使用12.5 µL的每種相應(yīng)試劑代替25 µL 。注意：測試樣品可以是非刺激或刺激的樣品。

2.2在cAMP標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照和測試樣品的每個孔中加入25 µL處理液（化合物重懸于緩沖液中），以使總cAMP測定體積為50 µL /孔。對于384孔板，將12.5 µL工作溶液添加到每個孔中，總體積為25 µL /孔。

2.3將反應(yīng)在室溫下孵育30分鐘。

2.4將25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液添加到cAMP標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照和測試樣品的每個孔中，使總cAMP測定體積為75 µL /孔。對于384孔板，將12.5 µL工作溶液添加到每個孔中，總體積為37.5 µL /孔。注意：對于陰性對照，可以添加裂解緩沖液。

2.5將25 µL cAMP-trFluor Eu工作溶液添加到cAMP標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照和測試樣品的每個孔中，使總cAMP測定體積為100 µL /孔。對于384孔板，在每個孔中加入12.5 µL工作溶液，總體積為50 µL。

2.6將反應(yīng)在室溫下孵育30分鐘。

2.7在兼容的TR-FRET（時間分辨熒光分析儀）上檢測。

表3.方案總結(jié)

表4.兼容的儀器匯總