分離細胞的檢測方案

概述

用密度為5×105到2×106個細胞/ mL的測試化合物制備細胞

將FAM-YVAD-FMK以1：150的比例加入到細胞溶液中

在室溫下孵育1小時

將細胞沉淀，用緩沖液或生長培養(yǎng)基洗滌并重懸細胞

在Ex / Em = 490 / 525nm處分析細胞

注：使用前將所有部件在室溫下解凍。

操作方法

1.根據您的特異性誘導方案，將細胞培養(yǎng)至適于細胞凋亡誘導的密度，但不超過2 x 106個細胞/ mL。同時，對于每種標記條件，以與誘導群體相同的密度培養(yǎng)非誘導的陰性對照細胞群。以下是一些誘導懸浮培養(yǎng)細胞凋亡的例子：

1）用2μg/ ml喜shu堿處理Jurkat細胞3小時。

2）用1μM星形孢菌素處理Jurkat細胞3小時。

3）用4μg/ ml喜shu堿處理HL-60細胞4小時。

4）用1μM星形孢菌素處理HL-60細胞4小時。

注意：應對每個細胞系進行單獨評估，以確定誘導細胞凋亡的細胞密度。

2.通過向FAM-YVAD-FMK（組分A）的小瓶中加入50μLDMSO制備150X FAM-YVAD-FMK DMSO儲備溶液。

3.將150×FAM-YVAD-FMK DMSO儲備溶液（來自步驟1）以1：150的比例添加到細胞溶液中，并將細胞在37℃，5％CO 2培養(yǎng)箱中孵育1小時。

注1：對于FAM-YVAD-FMK標記，細胞可以濃縮至~5×10 6個細胞/ mL。 未使用的150X FAM-YVAD-FMK DMSO儲備溶液應分為單次使用的等分試樣并儲存在-20°C。

注2：對于粘附細胞，用0.5mM EDTA輕輕提起細胞以保持細胞完整，并在用FAM-YVAD-FMK孵育之前用含血清的培養(yǎng)基洗滌細胞一次。

注3：適當的孵育時間取決于所用的細胞類型和細胞濃度。 優(yōu)化每個實驗的孵育時間。

4.將細胞以約200g旋轉5分鐘，并用1mL洗滌緩沖液（組分B）洗滌細胞兩次。 將細胞重懸于所需量的洗滌緩沖液中。

注1：FAM-YVAD-FMK是熒光的，因此清除任何未結合的試劑以消除背景非常重要。

注2：對于分離的細胞，應將細胞濃度調節(jié)至每個微量滴定板孔中2-5×10 5個細胞/100μL等分試樣，用于步驟6。

5.如果需要，用DNA染色標記細胞（如用于死細胞的碘化丙錠，或用于細胞核染色的整個群體的Hoechst）。

6.通過熒光顯微鏡，流式細胞儀或熒光酶標儀在Ex / Em = 490 / 525nm處檢測熒光強度（對于碘化丙錠，Ex / Em = 535/635 nm;對于Hoechst染料，Ex / Em = 350 / 461納米）。

6.1對于流式細胞儀，使用FL1通道監(jiān)測熒光強度（FL2通道用于碘化丙錠染色）。

6.2用于熒光顯微鏡和熒光酶標儀。將100μL細胞懸浮液置于96孔黑壁/微量滴定板透明底部的每個孔中。

注意：如果需要平衡細胞濃度，調整誘導細胞的懸浮體積以接近非誘導細胞群的細胞密度。如果您的細胞治療不會導致受刺激細胞群數量的顯著損失，則此調整步驟是可選的。

6.3使用FITC通道在熒光顯微鏡下觀察細胞（用于碘化丙啶染色的TRITC通道，用于Hoechst染色的DAPI通道）。

6.4使用熒光酶標儀，使用Ex / Em = 490 / 525nm（在515nm處截止）底部讀取模式監(jiān)測熒光強度。