樣本實(shí)驗(yàn)方案

簡(jiǎn)要概述

1.用測(cè)試化合物（100μL/孔/ 96孔板或25μL/孔/ 384孔板）制備細(xì)胞
2.加入等體積的Caspase 8工作溶液（100μL/孔/ 96孔板或25μL/孔/ 384孔板）
3.在室溫下孵育1小時(shí)
4.在Ex / Em = 535/620 nm（截止= 610 nm）監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度（頂部或底部讀取模式）

工作溶液配制

將5μL的200X Ac-LEHD-ProRed 儲(chǔ)備溶液（組分A）加入1mL的分析緩沖液（組分B）中并充分混合以制備Caspase 9工作溶液。 避光。 注意：Caspase 9工作液不穩(wěn)定，請(qǐng)及時(shí)使用。 1 mL Caspase 9工作溶液足以進(jìn)行10次分析。有關(guān)細(xì)胞樣品制備的指南，請(qǐng)點(diǎn)擊查看。

操作步驟

1.通過將10μL/孔的10X測(cè)試化合物（96孔板）或5μL/孔的5X測(cè)試化合物（384-板）加入PBS或所需緩沖液中來處理細(xì)胞。對(duì)于空白孔（沒有細(xì)胞的培養(yǎng)基），加入相同量的化合物緩沖液。

2.將細(xì)胞板在37℃，5％CO2，培養(yǎng)箱中孵育所需的一段時(shí)間（對(duì)于用星形孢菌素處理的Jurkat細(xì)胞3-4小時(shí)）以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3.添加100μL/孔/ 96孔或25μL/孔/ 384孔板的Caspase 9工作溶液。

4.將板在室溫下孵育至少1小時(shí)，避光。注意：如果需要，在室溫下加入Caspase 9工作溶液10分鐘前，向選定的樣品中加入1μL的1 mM Ac-LEHD-CHO caspase 9抑制劑，以確認(rèn)抑制caspase 9樣活性。

5.在Ex / Em = 540 / 620nm（cutoff= 610nm）下用熒光酶標(biāo)儀（頂部或底部讀取模式）監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。注意：有時(shí)，底部讀數(shù)會(huì)提供更好的信號(hào)背景比。如果使用底部讀取模式，則以800rpm離心細(xì)胞板（特別是對(duì)于非貼壁細(xì)胞）2分鐘 。