樣品實(shí)驗(yàn)方案

簡要概述

1. 用測試化合物準(zhǔn)備細(xì)胞

2. 加入等量的半胱天冬酶工作溶液

3. 在室溫下孵育30分鐘至1小時

4. 檢測熒光強(qiáng)度

溶液配制

工作溶液配制

1.單胱天蛋白酶活性工作液：將50 µL底物（組分A，B或C）加入10 mL分析緩沖液（組分D）中，制成caspase 3/7，caspase 8或caspase 9工作溶液，并充分混合。

2.雙胱天蛋白酶或三胱天蛋白酶活性工作液：將每種半胱天冬酶底物50 µL加到10 mL的測定緩沖液（組分D）中，制成工作溶液。 注意：請按比例準(zhǔn)備被測底物溶液和所需的體積。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.通過向PBS或所需的緩沖液中加入10 µL /孔的10X測試化合物（96孔板）或5 µL /孔的5X測試化合物（384-板）來處理細(xì)胞。對于空白孔（不含細(xì)胞的培養(yǎng)基），添加相同量的化合物緩沖液。

2.將細(xì)胞板在37°C，5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育（對于用星形孢菌素處理的Jurkat細(xì)胞需要3-5小時）以誘導(dǎo)凋亡。

3.加入100 µL /孔/ 96孔或25 µL /孔/ 384孔的所需caspase分析工作溶液。

4.在避光的條件下，在室溫下孵育平板至少30至60分鐘。注意：如果需要，可在室溫下添加測定上樣溶液10分鐘之前，向選定的樣品中添加1 µL 1 mM caspase抑制劑，以確認(rèn)對caspase活性的抑制。

5.按照頂部或底部讀取模式，檢測熒光強(qiáng)度。注意：有時，底部讀數(shù)可提供更好的信噪比，如果使用底部讀數(shù)模式，則以800 rpm的速度離心細(xì)胞板（特別是非貼壁細(xì)胞）2分鐘（制動）。