樣品實(shí)驗(yàn)方案

簡要概述

1. 用5×105至1×106細(xì)胞/ mL的密度制備含測試化合物的細(xì)胞

2. 將0.5 µL細(xì)胞溶液中加入1 µL 500X TF5-VAD-FMK

3. 將細(xì)胞在37°C，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育1-4小時(shí)

4. 沉淀細(xì)胞并將細(xì)胞重懸于0.5 mL檢測緩沖液或生長培養(yǎng)基中

5. 使用帶有660/20 nm濾光片的流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞（APC通道）

實(shí)驗(yàn)步驟

1.對于每個(gè)樣品，在0.5mL溫?zé)崤囵B(yǎng)基或自備緩沖液中以5×105至1×106cell/ mL的密度制備細(xì)胞。注意：應(yīng)單獨(dú)評(píng)估每種細(xì)胞系，以確定誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞密度。

2.用測試化合物處理細(xì)胞一段時(shí)間，以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并建立陽性和陰性對照。

3.向處理過的細(xì)胞中加入1µL 500X TF5-VAD-FMK（組分A）。

4.將細(xì)胞在37°C，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育1-4小時(shí)。注意：對于貼壁細(xì)胞，用0.5 mM EDTA輕輕提起細(xì)胞以保持細(xì)胞完整，并在與TF5-VAD-FMK孵育之前用含血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次。合適的孵育時(shí)間取決于所用的單個(gè)細(xì)胞類型和細(xì)胞濃度。優(yōu)化每個(gè)實(shí)驗(yàn)的孵育時(shí)間。

5.洗滌并旋轉(zhuǎn)細(xì)胞兩次。將細(xì)胞重懸于0.5 mL分析緩沖液（組分B）或生長培養(yǎng)基中。注意：TF5-VAD-FMK是熒光的；因此，重要的是洗凈任何未結(jié)合的試劑以除去背景。

6.可選：用DNA染色劑標(biāo)記細(xì)胞（例如綠色DCS標(biāo)記死細(xì)胞，可以用530/30 nm濾光片（FITC通道）檢測到。

7.可選：修復(fù)細(xì)胞。

8.使用帶有660/20 nm濾光片（APC通道）的流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。