樣品實(shí)驗(yàn)方案

簡(jiǎn)要概述

1. 用測(cè)試化合物制備細(xì)胞（200 µL /樣品）

2. 添加膜聯(lián)蛋白V-iFluor 647測(cè)定溶液

3. 在室溫下孵育30-60分鐘

4. 使用帶有660/20 nm濾光片（APC通道）的流式細(xì)胞儀或帶有Cy5濾光片組的熒光顯微鏡分析細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)步驟

1.用膜聯(lián)蛋白V-iFluor 647制備和孵育細(xì)胞：

1.1用測(cè)試化合物處理細(xì)胞一段時(shí)間（對(duì)于用星形孢菌素處理過(guò)的Jurkat細(xì)胞，需要4-6小時(shí)）以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

1.2離心細(xì)胞以獲得1-5×105細(xì)胞/管。

1.3將細(xì)胞重懸于200 µL分析緩沖液（組分B）中。

1.4向細(xì)胞中加入2 µL Annexin V-iFluor 647（組分A）。

1.5避光保存，于室溫下孵育30至60分鐘。

1.6在使用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡分析細(xì)胞之前，添加300 µL分析緩沖液（組分B）以增加體積。

1.7使用帶有660/20 nm濾光片的流式細(xì)胞儀（APC通道）或帶有Cy5濾光片組的熒光顯微鏡檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

2.通過(guò)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析：

2.1使用帶有660/20 nm濾光片（APC通道）的流式細(xì)胞儀定量膜聯(lián)蛋白V-iFluor 647的結(jié)合物。

3.通過(guò)使用熒光顯微鏡進(jìn)行分析：

3.1孵育后用移液管吸移細(xì)胞，用測(cè)定緩沖液沖洗1-2次，然后用測(cè)定緩沖液重懸細(xì)胞。

3.2將細(xì)胞添加到載玻片蓋玻片的載玻片上。 注意：對(duì)于貼壁細(xì)胞，建議直接在蓋玻片上生長(zhǎng)細(xì)胞。 與Annexin V-iFluor 647一起孵育后，用測(cè)定緩沖液沖洗1-2次，然后將測(cè)定緩沖液加回到蓋玻片上。 將玻片上的蓋玻片倒置并可視化細(xì)胞。 與膜聯(lián)蛋白V-iFluor 647孵育后，還可以將細(xì)胞固定在2％甲醛中，并在顯微鏡下觀察。

3.3使用Cy5濾光片組，在熒光顯微鏡下用Annexin V-iFluor 647分析凋亡細(xì)胞。當(dāng)?shù)饣V添加到細(xì)胞中時(shí)，通過(guò)使用TRITC通道測(cè)量細(xì)胞活力。質(zhì)膜上的橙色染色表明膜聯(lián)蛋白V-iFluor 647與細(xì)胞表面的PS結(jié)合。