鈣指示劑AM Esters的使用

1.帶有鈣指示劑AM酯：

AM酯是非極性酯，很容易穿過活細(xì)胞膜，并被活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞酯酶迅速水解。AM酯被廣泛用于wu創(chuàng)地將各種極性熒光探針裝載到活細(xì)胞中。但是，使用AM酯時(shí)必須特別注意，因?yàn)樗鼈円子谒?，特別是在溶液中。它們應(yīng)該用高質(zhì)量的無水二甲基亞砜（DMSO）進(jìn)行重構(gòu)。DMSO儲(chǔ)備溶液應(yīng)在-20°C的干燥環(huán)境中保存，并避光。在這些條件下，AM酯應(yīng)穩(wěn)定數(shù)月。

以下是我們推薦的將AM酯加載到活細(xì)胞中的方案。該方案僅提供指南，應(yīng)根據(jù)您的特定需求進(jìn)行修改。

a）在高質(zhì)量無水DMSO中制備2至5 mM AM酯儲(chǔ)備溶液。

b）在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將固體的鈣指示劑溶解在DMSO中，或?qū)⒌确值闹甘緞﹥?chǔ)備溶液解凍至室溫。在您選擇的含0.04％Pluronic®F-127的緩沖液（例如Hanks and Hepes緩沖液）中，準(zhǔn)備2至20 µM的工作溶液。對于大多數(shù)細(xì)胞系，我們建議鈣指示劑的終濃度為4-5 uM。必須根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定細(xì)胞加載所需指示劑的確切濃度。為避免因過載和潛在的染料毒性而導(dǎo)致的任何偽影，建議使用可以產(chǎn)生足夠信號強(qiáng)度的小探針濃度。

c）如果您的細(xì)胞（例如CHO細(xì)胞）中含有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，則可以將*磺舒（2–5 mM）或亞砜吡嗪（0.2–0.5 mM）添加到染料工作溶液中（孔濃度為1）*磺舒為-2.5 mM，亞磺酰吡嗪為0.1 -0.25 mM，以減少去酯化指示劑的泄漏。

d）將等體積的染料工作溶液（來自步驟b或c）添加到細(xì)胞板中。

e）在溫度或37°C下將染料加載板室孵育20分鐘（尤其是Fluo-8 AM）至2小時(shí)，然后在室溫下將板孵育30分鐘。

注1：降低加載溫度可能會(huì)減少指示器的分隔。

注2：將Cal-520 AM孵育2小時(shí)以上，對于某些細(xì)胞系會(huì)產(chǎn)生更好的信號強(qiáng)度。

f）用HHBS或您選擇的緩沖液（包含陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑，如1 mM*磺舒，如果適用）替換染料工作溶液，以除去過量的探針。

g）在所需的Ex / Em波長下運(yùn)行實(shí)驗(yàn)。

2.測量細(xì)胞內(nèi)鈣響應(yīng)

為了確定溶液的游離鈣濃度或單波長鈣指示劑的Kd，使用以下等式：

[Ca]free = Kd[F ─ Fmin]/Fmax ─ F]

其中F是實(shí)驗(yàn)鈣水平下指示劑的熒光，F(xiàn)min是不存在鈣時(shí)的熒光，F(xiàn)max是鈣飽和探針的熒光。

       解離常數(shù)（Kd）是探針對鈣的親和力的量度。 與校準(zhǔn)溶液相比，熒光指示劑的Ca結(jié)合和光譜性質(zhì)在細(xì)胞環(huán)境中變化非常顯著。 細(xì)胞內(nèi)指標(biāo)的原位反應(yīng)校準(zhǔn)通常產(chǎn)生顯著高于體外測定的Kd值。 通過在離子載體如A-23187,4-溴A-23187和離子霉素存在下將加載的細(xì)胞暴露于受控的Ca2+緩沖液來進(jìn)行原位校準(zhǔn)。 或者，細(xì)胞透化劑如洋地黃皂苷或X-100可用于將指示劑暴露于細(xì)胞外培養(yǎng)基的受控Ca2+水平。