使用Cal-520®AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯類

1.使用Cal-520®，Cal-590 或Cal-630 AM酯類：

       AM酯是非極性酯，其可以容易地穿過活細胞膜，并且通過活細胞內(nèi)的細胞酯酶快速水解。AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針加載到活細胞中。但是，使用AM酯時必須小心，因為它們易于水解，特別是在溶液中。它們應在使用前重新配制成高質(zhì)量的無水二甲基亞砜（DMSO）。DMSO儲備溶液可以在-20℃下干燥儲存并避光。在這些條件下，AM酯應穩(wěn)定數(shù)月。以下是我們推薦的將Cal-520®AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯加入活細胞的方案。該方案僅提供指南，應根據(jù)具體實驗修改。

a）在高質(zhì)量無水DMSO中制備2至5 mM Cal-520®AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM酯的儲備溶液。

b）在實驗當天，將Cal-520®AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM 溶解在DMSO中或?qū)⒌确莸闹甘緞﹥淙芤航鈨鲋潦覝亍Ｔ贖anks和Hepes緩沖液（HHBS）或您選擇的緩沖液中使用0.04％Pluronic®F-127制備10至20μM的染料工作溶液。細胞加載所需指示劑的確切濃度必須憑經(jīng)驗確定。

注意：非離子型洗滌劑Pluronic®F-127有時用于增加Cal-520®AM，Cal-590 AM或Cal-630 AM 酯的水溶性。

c）如果您的細胞（如CHO細胞）含有有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白，則可將丙*舒（1-2 mM）加入染料工作溶液中（濃度為0.5-1 mM）以減少滲漏。

d）將等體積的染料工作溶液（來自步驟b或c）加入細胞板中。

e）將染料加載板在細胞培養(yǎng)箱中孵育60至90分鐘，然后將板在室溫下再孵育30分鐘。

注意：孵育染料超過2小時可以為某些細胞系提供更好的信號強度。

f）用HHBS（如果適用）替換染料工作溶液，選擇含有陰離子轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑（如1 mM丙*舒）的緩沖液，以去除多余的探針。

g）在Ex / Em = 490 / 525nm（對于Cal-520 AM），540 / 5000nm（對于Cal-590 AM）或600 / 640nm（對于Cal-630 AM ）進行實驗。