適用儀器

樣品實驗方案

簡要概述

1. 在生長培養(yǎng)基中準備細胞

2. 用測試化合物處理細胞以誘導超氧化物

3. 添加MitoROS 580工作溶液

4. 在37°C下將細胞染色30-60分鐘

5. 檢測Ex / Em = 540/590 nm（截止= 570 nm）處的熒光增加（底部讀取模式）或使用配備TRITC濾光片的熒光顯微鏡

溶液配制

儲備溶液配制

1. MitoROS 580儲備溶液（500X）：將50 µL DMSO（組分C）添加到MitoROS 580（組分A）的小瓶中，并充分混合以制成500X MitoROS 580儲備液，避光。 注意：25 µL 500X MitoROS 580儲備溶液足以用于1個板。 為了存放，請將管子緊緊密封。

工作溶液配制

將25μL的500X MitoROS 580儲備溶液添加到10 mL的測定緩沖液（組分B）中，并充分混合以制成MitoROS 580工作溶液。 注意：此MitoROS 580工作溶液在室溫下至少可穩(wěn)定2小時。

實驗步驟

1. 在所需的緩沖液（例如PBS或HHBS）中，用10 µL 10X測試化合物（96孔板）或5 µL 5X測試化合物（384孔板）處理細胞。 對于對照孔（未處理的細胞），添加相應量的化合物緩沖液。

2. 為了誘導超氧化物，將細胞板在37°C下孵育所需的時間，避光。 注意：我們在37°C下用50 µM抗霉suA（AMA）處理HeLa細胞30分鐘，以誘導超氧化物。 有關詳細信息，請參見圖1。

3. 將100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的MitoROS 580工作溶液添加到細胞板中。

4. 將細胞在37°C下孵育30至60分鐘。

5. 使用熒光酶標儀（Ext / Em = 540/590 nm（Cutoff = 570 m））檢測熒光強度，或者使用帶有TRITC濾光片的熒光顯微鏡觀察細胞。