樣本實(shí)驗(yàn)方案

概述

1.準(zhǔn)備細(xì)胞（0.5-1×106細(xì)胞/ mL）
2.添加1 µL 500X Nitrixyte 紅色
3.將細(xì)胞與測(cè)試化合物和Nitrixyte Red在37oC下孵育所需的時(shí)間
4.使用FL4通道的流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞

溶液配制

1.儲(chǔ)備溶液

所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。 避免重復(fù)凍融循環(huán)。
1.1 NONOate陽性對(duì)照儲(chǔ)備液（50 mM）：
將200 uL ddH2O加入小瓶NONOate陽性對(duì)照（組分B）中，制成50 mM NONOacte陽性對(duì)照處理原液。

2.工作溶液

用測(cè)定緩沖液（組分C）稀釋50 mM NONOate陽性對(duì)照原液，制成1-2 mM NONOate陽性對(duì)照工作溶液。

樣品操作及實(shí)驗(yàn)分析

1.對(duì)于每個(gè)樣品，在0.5 mL溫?zé)崤囵B(yǎng)基或您選擇的緩沖液中以5×105至1×106細(xì)胞/ mL的密度制備細(xì)胞。注意：應(yīng)單獨(dú)評(píng)估每個(gè)細(xì)胞系，以確定誘導(dǎo)NO的佳細(xì)胞密度。

2.向0.5 mL細(xì)胞懸液中加入1 µL 500X Nitrixyte Red（組分A）。注意：對(duì)于粘附細(xì)胞，用0.5 mM EDTA輕輕提起細(xì)胞以保持細(xì)胞完整，并在與Nitrixyte Red孵育之前用含血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次。

3.將細(xì)胞與測(cè)試化合物和Nitrixyte Red在37oC下孵育所需的時(shí)間，以生成內(nèi)源性或外源性NO。注意：適當(dāng)?shù)姆跤龝r(shí)間取決于所用的單個(gè)細(xì)胞類型和測(cè)試化合物。優(yōu)化每個(gè)實(shí)驗(yàn)的孵育時(shí)間。注意：我們已在37℃的細(xì)胞培養(yǎng)基中使用Raw 264.7細(xì)胞與Nitrixyte Red工作溶液，20μg/ mL脂多糖（LPS）和1 mM L-精an酸（L-Arg）孵育16小時(shí)。

4.降低已經(jīng)用Nitrixyte Red預(yù)孵育30分鐘的細(xì)胞。用1 mM DEA NONOate陽性對(duì)照工作溶液重懸細(xì)胞，并在37oC下再孵育30分鐘。有關(guān)詳細(xì)信息，請(qǐng)參見圖1。

5.使用流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)FL4通道（Ex / Em = 630/660 nm）處的熒光強(qiáng)度。