用Tide Fluor 染料標(biāo)記氨基修飾的寡核苷酸

以下方案已經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可用于標(biāo)記200μg（~6 A260 nm單位）的專(zhuān)有寡核苷酸。 您需要根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)調(diào)整相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)步驟以達(dá)到實(shí)驗(yàn)的佳效果。 您的氨基改性O(shè)LIGO必須進(jìn)行處理以去除快速反應(yīng)并消耗染料SUCCINIMIDYL酯的氨。

1.準(zhǔn)備Oligo溶液

1.1將氨基修飾的oligo（~200μg）溶解在四硼酸鹽緩沖液（100μL，pH 8.5±0.5）中。

注1：寡核苷酸必須在5'末端用胺基合成。 參見(jiàn)Appenxidx 1純化氨基修飾的寡核苷酸。

注2：避免使用含有伯胺的緩沖液，如Tris，因?yàn)樗鼈兣c胺反應(yīng)性化合物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。

2.準(zhǔn)備染料溶液

2.1通過(guò)上下吸移將1mg染料SE溶解在100μLDMSO中（如果可能，> 10mg / mL）。 將小瓶側(cè)面的溶液原液離心至小瓶底部。

注意：在開(kāi)始綴合之前準(zhǔn)備DMSO染料溶液。 染料溶液的長(zhǎng)期儲(chǔ)存可降低染料活性。 任何含有染料的溶液都應(yīng)避光。 我們不建議您存儲(chǔ)DMSO染料溶液以備將來(lái)使用。

3.運(yùn)行共軛反應(yīng)

3.1在攪拌或搖動(dòng)（保持反應(yīng)混合物避光）的同時(shí)向染料溶液（B，20-50μL）中加入寡聚物溶液（A，100μL）。

3.2在室溫下在旋轉(zhuǎn)器或振蕩器上旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)反應(yīng)混合物4-6小時(shí)。

注意：在第一個(gè)小時(shí)內(nèi)每10分鐘輕輕渦旋一下小瓶，以確保反應(yīng)溶液保持充分混合。 不要?jiǎng)×一旌?，因?yàn)椴牧峡赡芰粼谛∑康膬蓚?cè)。 六小時(shí)后，應(yīng)標(biāo)記50-90％的胺修飾的寡核苷酸分子。 如果更方便的話，反應(yīng)可以孵育過(guò)夜。 然而，在大多數(shù)情況下，過(guò)夜孵育不會(huì)導(dǎo)致更高的標(biāo)記效率。

4.純化染料 - 寡糖結(jié)合物

4.1通過(guò)乙醇沉淀標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行初步純化

4.1.1將20μL（一般十分之一反應(yīng)溶液體積）的3M NaCl和300μL冷無(wú)水乙醇（通常為兩個(gè)半反應(yīng)溶液體積）加入反應(yīng)小瓶中。

4.1.2充分混合溶液并將其置于-20℃下30分鐘。

4.1.3將該溶液在微量離心機(jī)中以10,000至15,000×g離心30分鐘。

注意：如果離心時(shí)間不夠長(zhǎng)，可能會(huì)導(dǎo)致樣品丟失。

4.1.4小心取出上清液，用冷的70％乙醇沖洗沉淀1-3次并短暫干燥。

注意：一些未反應(yīng)的標(biāo)記試劑可能在反應(yīng)過(guò)程中沉淀或可能粘在反應(yīng)瓶的壁上。在離心之前，通過(guò)大量渦旋混合將該材料全部再溶解。重新溶解標(biāo)記試劑可確保沉淀的寡核苷酸少被未反應(yīng)的標(biāo)記物污染。

4.2通過(guò)HPLC或凝膠電泳進(jìn)行終純化

使用Tide Fluor 染料標(biāo)記肽

以下方案已經(jīng)過(guò)優(yōu)化，用于標(biāo)記10 mg僅含有一個(gè)游離氨基的肽（MW~2000）。您需要根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)，調(diào)整相應(yīng)的步驟以達(dá)到佳的實(shí)驗(yàn)效果。

1.制備肽溶液（溶液A）

1.1將肽（~10 mg）溶解在DMF（~1 ml）中。

注1：肽必須用堿如三乙胺或碳酸鉀中和。

注2：避免使用含有伯胺的緩沖液，如Tris，因?yàn)樗鼈兣c胺反應(yīng)性化合物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。

2.準(zhǔn)備染料溶液（溶液B）

2.1通過(guò)上下吸移將5mg染料SE溶解在500μLDMF中（如果可能，> 10mg / mL）。

注意：在開(kāi)始綴合之前準(zhǔn)備DMF染料溶液。染料溶液的長(zhǎng)期儲(chǔ)存可降低染料活性。任何含有染料的溶液都應(yīng)避光。我們不建議您存儲(chǔ)DMF染料溶液以備將來(lái)使用。

3.運(yùn)行共軛反應(yīng)

3.1向染料溶液（B，500μL）中加入肽溶液（A，1mL），攪拌或搖動(dòng)（保持反應(yīng)混合物不發(fā)光）。

3.2在室溫下攪拌反應(yīng)混合物4-6小時(shí)。

4.純化染料 - 肽綴合物

4.1濃縮反應(yīng)溶液并在C18柱上純化，得到所需的綴合物。通過(guò)HPLC分析級(jí)分，合并> 97％純度的級(jí)分并凍干。

注1：HPLC純化條件：TEAB緩沖液（三乙基碳酸氫銨，0.25mmol，pH = 7.0-8.0）用作緩沖液A，乙腈用作緩沖液B. HPLC在60分鐘內(nèi)從0％B至30％B進(jìn)行（流速：100毫升/分鐘）。

注2：操作過(guò)程中避免強(qiáng)光。