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閱讀：69發(fā)布時(shí)間：2022-11-30
菌種的保藏是無菌檢驗(yàn)、微生物限度檢驗(yàn)工作中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。用人工方法低溫、干燥、缺氧、缺營養(yǎng)等方法控制微生物的代謝，使細(xì)胞基本上處于休眠狀態(tài)，繁殖受到抑制但仍保持菌種原有的各種生物學(xué)特性，以達(dá)到保種的目的。菌種保藏的關(guān)鍵是不變異、不污染、不死亡。
1.菌種保藏步驟1.1挑選特征典型的純菌菌落。其方法是用接種環(huán)挑取少許菌苔，接種至2ml營養(yǎng)肉湯或0.9%氯化鈉溶液中制成菌液，再取一環(huán)菌液在營養(yǎng)瓊脂平板上分區(qū)劃線，培養(yǎng)后可見單個(gè)菌落生長。1.2凡能產(chǎn)生孢子或芽胞的微生物都用孢子和芽孢進(jìn)行保種。孢子和芽胞的代謝作用較弱，但對(duì)惡劣環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗。在傳代前，將菌液管放入80℃水浴中作用30分鐘，殺死雜菌繁殖體后用芽孢傳代。 1.3定期對(duì)保藏菌種進(jìn)行檢查、分離、純化，以防菌種變異及衰退，檢查項(xiàng)目包括菌落形態(tài)、染色、鏡檢、生化特性及血清學(xué)檢查。1.4選擇適宜的培養(yǎng)基及保藏方法。
2.常用菌種的保藏方法2.1普通瓊脂斜面 用于常用菌株的傳代。在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)按0.5%加入瓊脂粉配制而成。接種培養(yǎng)后，將菌種管用硅膠塞塞緊，置4℃冰箱保存，每隔2～3個(gè)月傳種1次。銅綠假單孢菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，其菌種須放25℃培養(yǎng)箱內(nèi)保存。
2.2半固體瓊脂 用于常用菌株的傳代。在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)按0.5%加入瓊脂粉配制而成。穿刺接種培養(yǎng)后，置4℃冰箱保存，6個(gè)月傳種1次。如在培養(yǎng)管內(nèi)加少量無菌液體石蠟隔絕空氣，減少水分蒸發(fā)，可延長菌種的保藏期。2.3真菌瓊脂斜面 用于真菌的傳代。在真菌培養(yǎng)基內(nèi)按1.3%加入瓊脂粉配制而成。劃線接種后，20～25℃培養(yǎng)24小時(shí)，置4℃冰箱保存，3～6個(gè)月傳種1次。2.4沙氏瓊脂斜面 用于真菌的傳代。配方：蛋白胨10g ，葡萄糖10g，瓊脂粉13g，加蒸餾水1000ml，待上述成分溶化后，搖勻分裝，115℃滅菌20分鐘，趁熱擺成斜面。劃線接種后，20～25℃培養(yǎng)24小時(shí)，置4℃冰箱保存，3～6個(gè)月傳種1次。 2.5 40%甘油水 用于細(xì)菌的傳代。配制方法：甘油40ml加水至100ml即成。分裝至試管內(nèi)，每支2ml左右，121℃滅菌20分鐘備用。接種細(xì)菌后直接放4℃冰箱保存，6～12個(gè)月傳代1次。 2.6需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基 用于生孢梭菌的傳代。取生孢梭菌CMCCB64941菌液1ml至需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基15ml內(nèi)，30～35℃培養(yǎng)18～24h，置4℃冰箱內(nèi)保存3～6個(gè)月傳種1次。 2.7 皰肉培養(yǎng)基 用于破傷風(fēng)梭菌的傳代。取破傷風(fēng)梭菌CMCCB64067菌液0.1ml接種于皰肉培養(yǎng)基內(nèi)，36℃±1℃厭氧培養(yǎng)3～4天，置4℃冰箱保存，6～12個(gè)月傳代1次。 2.8 液氮超低溫保藏法 適用于各類微生物的保藏。液氮溫度可達(dá)-196℃，此時(shí)菌種的新陳代謝活動(dòng)已停止，但不會(huì)死亡。在配制好的菌液內(nèi)加10%甘油作為保護(hù)劑，分裝于安瓿中，置液氮罐內(nèi)可保存10年之久。2.9冷凍真空干燥保藏法 本法廣泛適用于各類微生物的保藏，包括病毒和噬菌體。將菌液混于有保護(hù)作用的介質(zhì)內(nèi)，分裝于滅菌菌種管內(nèi)，速凍后抽真空，使菌液很快變?yōu)槭杷傻母稍锞郏詈笤谡婵諣顟B(tài)下密封管口，菌種保存期最長可達(dá)20年以上。
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