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碧云天試劑-乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒-C0016

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更新時間:2023-06-17 07:28:25瀏覽次數(shù):237次

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碧云天試劑-乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒-C0016也稱乳酸脫氫酶檢測試劑盒(LDHReleaeAayKit)可以用于常規(guī)的乳酸脫氫酶活性的檢測,更常用于以LDH釋放為指標的細胞毒性檢測。同時,基于細胞總?cè)樗崦摎涿富钚缘臋z測,本試劑盒也可以用于檢測細胞增殖和細胞毒性檢測。

碧云天試劑-乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒-C0016

產(chǎn)品編號 產(chǎn)品名稱 產(chǎn)品包裝
C0016 乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒 100次
C0017 乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒 500次

   碧云天的乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit),也稱乳酸脫氫酶檢測試劑盒(LDH Assay Kit)或乳酸脫氫酶釋放檢測試劑盒(LDH Release Assay Kit),是一種基于diaphorase催化的INT顯色反應(yīng),通過比色法檢測細胞毒性時釋放的乳酸 脫氫酶活性或檢測其它樣品中的乳酸脫氫酶活性的試劑盒。
本試劑盒可以用于常規(guī)的乳酸脫氫酶活性的檢測,更常用于以LDH釋放為指標的細胞毒性檢測。同時,基于細胞總?cè)樗崦摎涿富钚缘臋z測,本試劑盒也可以用于檢測細胞增殖和細胞毒性檢測。
細胞凋亡或壞死而造成的細胞膜結(jié)構(gòu)的破壞會導(dǎo)致細胞漿內(nèi)的酶釋放到培養(yǎng)液里,其中包括酶活性較為穩(wěn)定的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)。通過檢測從質(zhì)膜破裂的細胞中釋放到培養(yǎng)液中的LDH的活性,就可以實現(xiàn)對細胞毒性的定量分析。LDH釋放被看做細胞膜完整性的重要指標,并被廣泛用于細胞毒性檢測。LDH釋放被認為是以前使用放射性的51Cr標記細胞,隨后通過51Cr釋放進行 細胞膜完整性檢測的安全有效的替代方法。
本試劑盒的基本原理是,在乳酸脫氫酶的作用下,NAD+被還原生成NADH,NADH和INT (2- p -iodophenyl-3-
nitrophenyl tetrazolium chloride)被硫辛酰胺脫氫酶(diaphorase)催化反應(yīng)生成NAD +和強生色物甲臜(formazan),在490nm波長下產(chǎn)生吸收峰,從而可以通過比色來定量乳酸脫氫酶的活性。吸光度與乳酸脫氫酶活性成線性正相關(guān)。該酶聯(lián)反應(yīng)原理的示意圖如下:

可檢測細胞培養(yǎng)液、細胞裂解液等樣品中乳酸脫氫酶的活性。一個試劑盒可進行100次檢測。
包裝清單:

產(chǎn)品編號 產(chǎn)品名稱 包裝
C0016-1 LDH釋放試劑 1.5ml
C0016-2 乳酸溶液 2ml
C0016-3 酶溶液 1ml×2
C0016-4 INT溶液(10X) 0.2ml
C0016-5 INT稀釋液 2ml
說明書 1份


保存條件:
-20℃保存,一年有效。C0016-3需注意避免反復(fù)凍融。C0016-4需避光保存。試劑盒解凍后可以短期4℃存放,2-3天內(nèi)有效。
注意事項:
冷凍會使樣品中部分乳酸脫氫酶失活,4℃可放置2-3天。建議樣品準備好后盡量當天完成測定。
如果檢測細胞培養(yǎng)液中的乳酸脫氫酶,由于血清含有乳酸脫氫酶,建議血清的使用濃度不要超過1%,并使用熱滅活血清。如果一定需要使用10%血清,在檢 測時一定要設(shè)置沒有細胞,但加入了相同體積培養(yǎng)液的對照孔,以用于消除背景。
細胞過度生長、密度過高、離心速度過大、培養(yǎng)箱內(nèi)外溫差過大,都會造成細胞釋放乳酸脫氫酶增加。
如果希望進行乳酸脫氫酶活性的定量,用戶需自備乳酸脫氫酶標準品。


使用說明:
1.樣品的準備:
方法一:LDH釋放檢測
a.根據(jù)細胞的大小和生長速度將適量細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板中,使待檢測時細胞密度不超過80-90%滿。
b.吸去培養(yǎng)液,用PBS液洗滌一次。換新鮮培養(yǎng)液(推薦使用含1%血清的低血清培養(yǎng)液或適當?shù)臒o血清培養(yǎng)液),將各培養(yǎng)孔分成如下幾組:包括無細胞的培養(yǎng)液孔(背景空白對照孔),未經(jīng)藥物處理的對照細胞孔(樣品對照孔),未經(jīng)藥物處理的用于后續(xù)裂解的細胞孔(樣品酶活性對照孔),以及藥物處理的細胞孔(藥物處理樣品孔),并做好標記。按照實驗需要給予適當藥物處理如加入0-10μl左右特定的藥物刺激,可設(shè)置不同濃度,不同處理時間,對照孔中需加入適當?shù)乃幬锶軇φ?,繼續(xù)按常規(guī)培養(yǎng)。到預(yù)定的檢測時間點前1小時,從細胞培養(yǎng)箱里取出細胞培養(yǎng)板,在“樣品max酶活性對照孔"中加入試劑盒提供的LDH釋放試劑,加入量為原有培養(yǎng)液體積的10%。加入LDH釋放試劑后,反復(fù)吹打數(shù)次混勻,然后繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中孵育。
c.到達預(yù)定時間后,將細胞培養(yǎng)板用多孔板離心機400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl,加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中,隨即進行樣品測定。


方法二:細胞內(nèi)總LDH的檢測
a.細胞毒性檢測:根據(jù)細胞的大小和生長速度將適量細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)孔板中,使待檢測時細胞密度不超過80-90%滿。加入不同藥物進行處理,并設(shè)置適當對照。藥物刺激完畢后,將細胞培養(yǎng)板用多孔板離心機400g離心5min。盡量吸除上清,加入150μl用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的LDH釋放試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻,適當搖晃培養(yǎng)板混勻,然后繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中孵育1小時。隨后將細胞培養(yǎng)板用多孔板離心機400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl,加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中,隨即進行樣品測定。
b.細胞增殖檢測:根據(jù)細胞的大小和生長速度將適量細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)孔板中,使促進細胞增殖的藥物刺激后細胞不超過80-90%滿為宜。使用不同的藥物刺激細胞,并設(shè)置適當對照。藥物刺激完畢后,將細胞培養(yǎng)板用多孔板離心機400g離心5min。盡量吸除上清,加入150μl用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的LDH釋放試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻),適當搖晃混勻胞,然后繼續(xù)在細培養(yǎng)箱中孵育1小時。隨后將細胞培養(yǎng)板用多孔板離心機400g離心5min。分別取各孔上清液120μl,加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中,隨即進行樣品測定。
注:LDH釋放檢測更加常用一些,細胞內(nèi)總LDH檢測通??梢允褂肕TT、WST-1或CCK-8等方法替代。
2.  試劑盒的準備工作:
a.INT溶液(1X)的配制:根據(jù)所需的INT溶液(1X)的量,取適量INT溶液(10X)用INT稀釋液稀釋至1X。例如,取20μl INT溶液(10X),加入180μl INT 稀釋液,混勻后即配制為200μl INT溶液(1X)。INT溶液(1X)宜現(xiàn)配現(xiàn)用,配制后4℃保存可于當天使用,不宜配制后凍存。
b.LDH檢測工作液的配制: 根據(jù)待測定的樣品數(shù)(含對照),參考下表在臨檢測前新鮮配制適量的檢測工作液。
注意:LDH檢測工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用,配制和使用過程中均要注意適當避光。

檢測次數(shù) 1次 10次 20次 50次
乳酸溶液 20μl 200μl 400μl 1ml
INT溶液(1X) 20μl 200μl 400μl 1ml
酶溶液 20μl 200μl 400μl 1ml
總體積 60μl 600μl 1.2 ml 3ml


c.(選做)如果希望進行LDH酶活性的定量,需自備LDH標準品,并新鮮配制不同濃度LDH標準品,如10mU/ml、5mU/ml、2.5mU/ml、1.25mU/ml、 0.65mU/ml、0 mU/ml。

3. 樣品測定:
a.各孔分別加入60μl LDH檢測工作液。
b.混勻,室溫(約25℃) 避光孵育30min(可用鋁箔包裹后置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動)。然后在490nm處測定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一 波長作為參考波長進行雙波長測定。
c.計算(測得的各組吸光度均應(yīng)減去背景空白對照孔吸光度)
d.細胞毒性或死亡率(%)=(處理樣品吸光度-樣品對照孔吸光度) / (細胞酶活性的吸光度-樣品對照孔吸光度)×100
e.可繪制細胞毒性曲線:縱座標為實際吸光度,橫坐標為藥物濃度;據(jù)此可計算該藥物作用特定時間的半致死劑量LD50。

附錄1:
可同時測定一已知濃度的LDH酶標準品對應(yīng)的吸光度值,參考以下公式粗略計算出樣品中LDH酶活力:
待測樣品中LDH活力單位(mU/ml)=
(樣品孔吸光度-背景空白對照孔吸光度) / (標準管吸光度-標準空白管吸光度)×標準品濃度(mU/ml);
根據(jù)計算結(jié)果可以比較不同樣品處理組間有無統(tǒng)計學(xué)差異等。

附錄2:
若需準確計算出LDH酶活性的活性,可通過一系列LDH標準品及相應(yīng)測得的吸光度值繪制標準曲線,通過標準曲線相應(yīng)公式計算出樣品中LDH的酶活性。
各孔數(shù)值減去空白對照后,以檢測的吸光度(OD490)為縱坐標,LDH酶活力(mU)為橫坐標,繪制LDH標準曲線。同時計算出該趨勢線的公式。

A490nm=k×LDH酶活力單位(mU)+b,通過Excel等軟件計算 出趨勢線的斜率k和截距b。
根據(jù)上述公式計算樣品中LDH活力。
樣品實際吸光度(OD490)=樣品孔測得的吸光度-背景空白對照孔吸光度
檢測體系中LDH酶活力單位(mU)=(OD490-b)/k
樣品中LDH酶活力(mU/ml)=檢測體系中LDH酶活力單位(mU )/檢測樣品體積




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