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YIJI植物丙酮酸脫氫酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase）總活性光度法定量

檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI植物丙酮酸脫氫酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase）總活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過特異反應(yīng)系統(tǒng)中氧化型*腺嘌呤二核苷酸（NAD）還原后峰值的增高，即采用光度法來測定植物組織裂解樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種植物組織，包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）、胚胎葉（cotyledon）、上胚軸（epicotyl）等丙酮酸脫氫酶激酶的總活性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

丙酮酸脫氫酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase；PDK；EC2.7.11.2或EC2.7.1.99），又稱為丙酮酸脫氫酶復(fù)合物激酶（pyruvate dehydrogenase complex kinase），屬于*/*激酶家族成員之一，位于線粒體基質(zhì)內(nèi)。其功能在于調(diào)節(jié)碳水化合物代謝，控制PDH活化狀態(tài)，通過可逆性磷酸化丙酮酸脫氫酶（E1）α亞體上的*殘基，以達到ATP依賴性丙酮酸脫氫酶失活，降低丙酮酸氧化，增強丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸。PDK短期調(diào)節(jié)是由糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸以及ADP等抑制其活性，而線粒體內(nèi)乙酰*和NADH水平增高激活其活性。哺乳動物丙酮酸脫氫酶激酶分為4個同工酶，而植物有1至2個同工酶：玉米和水稻有2種，擬南芥有1種。其中植物PDK1主要位于葉部，在植物生長發(fā)育的整個過程中高達表達，而PDK2存在于所有組織器官，與光合作用有關(guān)。通過抑制PDK活性，可以改變植物生長表型，提高生長產(chǎn)率（包括種子重量或含油量增加），花期提前，周期縮短。植物同工酶具有70至77%的同源性，而與哺乳動物只有37%同源性，其結(jié)構(gòu)與原核生物*激酶（histidine kinase）相同。 基于底物丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase；PDH），在ATP存在與否的情況下，受到丙酮酸脫氫酶激酶的磷酸化后，其輔酶因子氧化型*腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；β-NAD）轉(zhuǎn)化為還原型*腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；β-NADH）產(chǎn)生變化，通過測定吸光值（340nm 波長），來定量分析丙酮酸脫氫酶激酶的總活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI清理液（Reagent A）  毫升

YIJI裂解液（Reagent B）  毫升

YIJI緩沖液（Reagent C）  毫升

YIJI反應(yīng)液（Reagent D）       毫升

YIJI底物液（Reagent E）       毫升

YIJI陰性液（Reagent F）    毫升

YIJI專性液（Reagent G）            微升

產(chǎn)品說明書      1份

保存方式

保存YIJI裂解液（Reagent B）、YIJI緩沖液（Reagent C）、YIJI反應(yīng)液（Reagent D）、YIJI底物液（Reagent E）和YIJI專性液（Reagent G）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；YIJI反應(yīng)液（Reagent D）和YIJI底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

DOUNCE勻漿器：用于組織勻化

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析的容器

分光光度儀或酶標儀：用于光度分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的YIJI裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

• 樣品準備

• 準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進一個預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的xx毫升YIJI裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放進預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）
• 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管，放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復(fù)離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 即刻移入到1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

• 測定準備

• 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長340nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；YIJI底物液（Reagent E）避免光照
• YIJI緩沖液（Reagent C）在室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent F）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

• 樣品總活性測定

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入5微升待測樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)） 

• 樣品非特異活性測定

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI專性液（Reagent G）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent E）
• 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入5微升待測樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

• 計算樣品活性

1）樣品活性（總活性和非特異活性）

2）樣品特異活性

• 酶標儀測定

1）樣品總活性測定

• 在96孔板上做好相應(yīng)標記：背景對照和樣品總活性
• 分別移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 分別加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent D）
• 分別加入xx微升YIJI底物液（Reagent E）
• 輕輕搖動96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入xx微升YIJI陰性液（Reagent F）或待測樣品（100微克蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)

2）樣品非特異活性測定

• 在96孔板上做好相應(yīng)標記：待測樣品
• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI專性液（Reagent G）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent E） 
• 輕輕搖動96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入5微升待測樣品（注意：100微克蛋白）
• 輕輕搖動96孔板

• 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)

• 樣品特異活性計算

（1）樣品活性（總活性和非特異活性）

（2）樣品特異活性

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 建議使用比色皿測定
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 加樣后3秒內(nèi)光度測定
• 測定值由低到高變化；測定可持續(xù)5分鐘
• 光度測定后，比色皿須清洗*
• 樣本測定5分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/5微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供 YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 丙酮酸脫氫酶激酶單位活性定義為：在30℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠抑制轉(zhuǎn)化1微摩爾丙酮酸至乙酰*所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列丙酮酸脫氫酶通路分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感

訂購信息

單組分訂購信息

編號 名稱 規(guī)格

YJ50777.4 YIJI植物丙酮酸脫氫酶激酶總活性光度法定量檢測試劑盒 20次

YJ50777.4A YIJI清理液（Reagent A）     毫升

YJ50777.4B YIJI裂解液（Reagent B）      毫升

YJ50777.4C YIJI緩沖液（Reagent C）     毫升

YJ50777.4D YIJI底物液（Reagent D）      毫升

YJ50777.4E YIJI反應(yīng)液（Reagent E）      毫升

YJ50777.4F YIJI陰性液（Reagent F） 毫升

YJ50777.4G  YIJI專性液（Reagent G） 毫升

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