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MicroRNA
點擊次數(shù)：1198 發(fā)布時間：2013-8-20
MicroRNA的概念
MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)生的、長度約20-24個核苷酸的小RNA,是發(fā)夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成。其在細胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個基因。這種復雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡既可以通過一個miRNA來調(diào)控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNAs的組合來精細調(diào)控某個基因的表達。隨著miRNA調(diào)控基因表達的研究的逐步深入，將幫助我們理解高等真核生物的基因組的復雜性和復雜的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡。miRNA廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，其本身不具有開放閱讀框（ORF）。成熟的miRNA，5′端有一個磷酸基團，3′端為羥基。編碼miRNAs的基因zui初產(chǎn)生一個長的pri-RNA分子，這種初期分子還必須被剪切成約70-90個堿基大小、具發(fā)夾結構單鏈RNA前體（pre-miRNA）并經(jīng)過Dicer酶加工后生成。成熟的miRNA 5’端的磷酸基團和3´端羥基則是它與相同長度的功能RNA降解片段的區(qū)分標志。miRNA 5'端*個堿基對U（尿苷）有強烈的傾向性，而對G卻排斥，但第二到第四個堿基缺乏U。一般來講，除第四個堿基外，其他位置堿基通常都缺乏C。這些分子能夠與那些和它的序列互補的mRNA分子相結合，有時候甚至可以與特定的DNApian斷結合。這種結合的結果就是導致基因的沉默。這種方式是身體調(diào)節(jié)基因表達的一個重要策略。據(jù)推測，miRNA調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因。
MicroRNA形式
1. pre-miRNA
約70bp含microRNA莖環(huán)結構的pre-miRNA。
制備方式：化學合成、生物轉錄合成、pre-miRNA質(zhì)粒表達載體、pre-miRNA病毒。
2. pri－miRNA
天然pri－miRNA
從染色體基因文庫中調(diào)取300bp－1000bp完整的microRNA基因，克隆到質(zhì)粒載體（普通載體或病毒載體），以強大的CMV啟動子操縱該300bp－1000bp microRNA。
人工pri－miRNA
選擇一個完整的microRNA基因，克隆到質(zhì)粒載體（普通載體或病毒載體）。以人工合成的約70bp含miRNA莖環(huán)結構的目標pre-RNA替代原pre-RNA，并以pol Ⅱ/pol III 啟動子操縱該microRNA結構單元。
的形式
的作用方式
miRNA基因是一類高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分為三種：*種以線蟲lin-4為代表，作用時與靶標基因不*互補結合，進而抑制翻譯而不影響mRNA的穩(wěn)定性（不改變mRNA豐度），這種miRNA是目前發(fā)現(xiàn)zui多的種類；第二種以擬南芥miR-171為代表，作用時與靶標基因*互補結合，作用方式和功能與siRNA非常類似，zui后切割靶mRNA；第三種以let-7為代表，它具有以上兩種作用模式：當與靶標基因*互補結合時，直接靶向切割mRNA，如果蠅和Hela細胞中l(wèi)et-7直接介導RISC分裂切割靶mRNA；當與靶標基因不*互補結合時，起調(diào)節(jié)基因表達的作用，如線蟲中的let-7與靶mRNA3´端非翻譯區(qū)不*配對結合后，抑制調(diào)節(jié)基因的翻譯。
MiRNA的特異性
研究表明MiRNAs在物種間具有高度的保守性、時序性和組織特異性——在特定的時間、組織才會表達。
細胞特異性或組織特異性是miRNA表達的主要特點，又如擬南芥中的miR-171僅在其花序中高水平表達，在某些組織低水平表達，在莖、葉等組織中卻無任何表達的跡象；20-24h的果蠅胚胎提取物中可發(fā)現(xiàn)miR-12，卻找不到miR3-miR6，在成年果蠅中表達的miR-1和let-7也無法在果蠅胚胎中表達，這同時體現(xiàn)了miRNA的又一特點——基因表達時序性。MiRNA表達的時序性和組織特異性暗示miRNA的分布可能決定組織和細胞的功能特異性，也可能參與了復雜的基因調(diào)控，對組織的發(fā)育起重要作用。
siRNA是RNAi途徑的主要作用物,miRNA和siRNA很容易混淆，他們有許多共同點也有許多不同點。為了能夠清楚地讓讀者弄清兩者之間的差異之處，筆者特別將它們之間的差別劃分入三個大的階段：起源階段、成熟階段和功能階段（即調(diào)節(jié)基因表達的作用階段）。
在描述兩者的差異之前，有必要先說一說它們的共同點：
1． MiRNA和siRNA都是由22個左右的核苷組成；
2． 它們都是Dicer酶的產(chǎn)物；
3． 它們在起干擾、調(diào)節(jié)作用時都會和RISC復合體結合；
4． 它們都可以在轉錄后和翻譯水平干擾以抑制靶標基因的翻譯；
miRNA與近親siRNA的差異
兩者之間的主要差異：
起源階段
SiRNA：通常是外源的，如病毒感染和人工插入的dsRNA被剪切后產(chǎn)生外源基因進入細胞（注：病毒入侵，或者是自身合成RNA中出現(xiàn)錯誤，細胞內(nèi)就會產(chǎn)生雙鏈RNA，來阻止這些異常基因的表達）。
MiRNA：是內(nèi)源性的，是一種非編碼的RNA；由miRNA基因表達出zui初的pri-miRNA分子。
成熟過程
SiRNA：直接來源是長鏈的dsRNA（通常為外源）；經(jīng)過Dicer酶*切割形成雙鏈siRNA,而且每個前體daRNA能夠被切割成不定數(shù)量的siRNApian段。
MiRNA：在細胞核中轉錄的較大的pri-miRNA經(jīng)由Drosha（一種RNAse Ⅲ酶）和Pasha（含有雙鏈RNA結合區(qū)域）加工成為單鏈pre-miRNA；接著，發(fā)夾狀、部分互補的pre-miRNA在細胞質(zhì)中被Dicer*（一種RNAse Ⅲ酶）酶切割形成miRNA；在生物體中的表達具有時序性、保守性和組織特異性。
功能階段
siRNA：它與RISC*（RNA誘導的沉默復合物，使用的AGO蛋白家族的成分為AGO2）結合，以RNAi途徑行使功能，即通過與序列互補的靶標mRNA*結合（與編碼區(qū)結合），從而降解mRNA以達到抑制蛋白質(zhì)翻譯的目的；它通常用于沉默外源病毒、轉座子活性。
MiRNA:它和RISC形成復合體（利用的AGO蛋白家族成員為AGO1）后與靶標mRNA通常發(fā)生不*結合，并且結合的位點是mRNA的非編碼區(qū)的3’端；它不會降解靶標mRNA，而只是阻止mRNA的翻譯； miRNA能夠調(diào)節(jié)與生長發(fā)育有關的基因。
注：RISC, RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex; RISC）的組裝是在RNAi和miRNA通路中zui為復雜的過程。新的研究表明，與siRNA和miRNA結合的RISC復合物并不*相同其中的AGO蛋白質(zhì)有AGO1和AGO2之分。剛產(chǎn)生的siRNAs和miRNAs都是雙鏈結構，這種雙鏈結構需要解螺旋才能被組裝到RISC中發(fā)揮作用。組裝后的復合物分別稱為siRISC和miRISC。從dsRNA引發(fā)RNAi的發(fā)生大致劃分為三個階段，即啟動、剪切和擴增。
Dicer酶：新的研究表明siRNA成熟需要Dicer-2和R2D2蛋白，而miRNA則依賴Dicer1和它的伴侶loqs蛋白。
選擇方法
1.pre-miRNA是zui早采用的microRNA，擁有大量的成功報道?；瘜W合成的pre-miRNA制備快捷，可以標記熒光等追蹤。缺點是制備的RNA穩(wěn)定性較差，而且，由于制備的microRNA較長，合成時RNA的錯誤難以避免（當合成RNA超過60bp時，出現(xiàn)一個堿基錯誤率約30％），轉錄制備的pre-miRNA穩(wěn)定性較好，但無flank結構，很少使用。質(zhì)粒載體形式的pre－miRNA也因為發(fā)現(xiàn)microRNA的flank對于microRNA功能和測定非常重要，現(xiàn)已逐漸被pri-miRNA取代。
2.人工pri-miRNA效果較pre-miRNA好，也有足夠多的成功使用的經(jīng)驗報道，但這種人工microRNA采用固定的mir155 flank，制備的microRNA功能不及天然原始microRNA，故也逐漸較少使用。
3.原始天然pri-miRNA克隆自天然文庫的microRNA由于保留了每個microRNA獨自的原始天然雙臂結構，效果更好，是近來被方法。
4.pre-miRNA或pri-miRNA腺病毒：可以轉染大多數(shù)絕細胞，產(chǎn)品質(zhì)量可靠。缺點是腺病毒有一定的毒性，以往實驗腺病毒毒性并未引起重視，但我們發(fā)現(xiàn)在microRNA實驗中顯得比較突出。另外，制備周期長，費用高也是不容忽視的缺點。
5.慢病毒microRNA：目前的microRNA實驗產(chǎn)品，缺點是慢病毒自身的不足，即制備lenti－virus時，病毒的質(zhì)量批間差異較大。
AAV、或retrovirus microRNA：與腺病毒和lenti－virus microRNA一樣，具有病毒產(chǎn)品的優(yōu)勢與缺點。