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西尼羅熱病IGM檢測試劑

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更新時間：2017-03-22 00:16:00瀏覽次數(shù)：268次

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廣州健侖生物科技有限公司

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產(chǎn)品簡介

西尼羅病毒IGM檢測試劑盒

詳細介紹

西尼羅病毒IGM檢測試劑盒

僅供科研使用

用途

美國FOCUS西尼羅河（West Nile）病毒IMM ELISA，利用了西尼羅重組抗原檢測人體血清或血漿中的西尼羅抗體。本實驗僅用于輔助診斷人感染了西尼羅病毒，不用于篩查血液或血液成分。僅供專業(yè)人員體外診斷使用。

概述

感染了西尼羅病毒會導(dǎo)致包括腦炎等一系列癥狀的疾病，西尼羅病毒在世界廣泛傳播，已在50多個國家檢測出該病毒。本試驗經(jīng)CDC提供的試劑檢驗與驗證。本試驗使用了一種稱為WNRA的重組抗原，它可以作為西尼羅病毒感染的快速血清學(xué)指標，WNRA蛋白是一種重組抗原，它是由含有西尼羅病毒兩個抗原的序列多肽構(gòu)成。

實驗的原理

檢測西尼羅病毒IMM ELISA 是基于兩步夾心法原理制造的。

提供的材料

1. 微孔板（96孔 12x8）：即用每孔均包被結(jié)合西尼羅重組抗原的單抗。2－8℃下保存至保質(zhì)期。

注意：WNRA和NCA已包被于微孔板。

2. IMM樣品稀釋液：1支 25ml 即用 2-8℃下保存至使用。

3. IMM陰性質(zhì)控：1支 30ul 2-8℃下保存至使用。要長時間儲存，將其分裝于小瓶里，在-70℃下儲存。

4. IMM陽性質(zhì)控：1支 30ul 2-8℃下保存至使用。要長時間儲存，將其分裝于小瓶里，在-70℃下儲存。

5. 洗滌液（10X）：1瓶 120ml 2－8℃下保存至使用。

6. EnWash：1瓶 20ml 2－8℃下保存至使用。

7. 酶聯(lián)物：一瓶6ml 即用 2－8℃下保存至使用。

8. TMB底物液： 1支 9ml 即用 2－8℃下保存至使用。

9. 終止液；1支6ml 即用 2－8℃下保存至使用。

試劑應(yīng)避免反復(fù)凍融。

操作步驟

在使用前將所有試劑和樣品平衡至室溫，并輕輕倒轉(zhuǎn)使其充分混勻。

實驗準備：

將10X的濃縮洗滌液稀釋,將120ml的濃縮洗滌液加上1080ml的蒸餾水，搖勻，至無任何沉淀，稀釋好的洗滌液zui多可在室溫下放置兩個星期。

準備實驗所需的板條，剩余的板條應(yīng)盡快放入袋子里重新密封，在2－8℃下儲存至保質(zhì)期。

操作步驟

1. 標記將要使用的板條，注意微孔板已經(jīng)按照統(tǒng)一排列，如下所述包被西尼羅抗原和質(zhì)控抗原。

西尼羅抗原
西尼羅抗原	板條＃1	板條＃2
A	WNRA	WNRA
B	WNRA	WNRA
C	WNRA	WNRA
D	WNRA	WNRA
E	NCA	NCA
F	NCA	NCA
M	NCA	NCA
H	NCA	NCA

2. 將血清樣品﹑陰性質(zhì)控和陽性質(zhì)控同樣地用樣品稀釋液按1：300稀釋。

3. 每孔加入50ul稀釋后的樣品，以下為一個血清樣品使用一個板條的*。

	板條1	板條2
	血清樣品
A	IMM N		樣品1
B	IMM N		樣品1
C	IMM P		樣品2
D	IMM P		樣品2
E	IMM P		樣品2
F	IMM P		樣品2
M	IMM N		樣品1
H	IMM N		樣品1

4. 封板，在濕潤的溫育器里37℃下溫育1小時。

5. 溫育后，用自動洗板機，使用洗滌液洗板6次。

6. 在每孔中加入50ul的酶聯(lián)物。

7. 封板，在濕潤的溫育器里37℃下溫育1小時。

8. 溫育后，用自動洗板機，使用洗滌液洗板6次。

9. 每孔加入150ul的EnWash，在室溫下溫育5分鐘

10. 溫育后，用自動洗板機，使用洗滌液洗板6次。

11. 每孔加入75ul的TMB底物液。

12. 封板，在室溫下，避光處溫育10分鐘。

13. 每孔加入50ul的終止液終止反應(yīng)。

14. 在450nm處讀取吸光率。

結(jié)果的計算

結(jié)果的變化將會非常大，以下結(jié)果僅供指引。

計算ISR值：

計算在同一實驗里WNR抗原的兩個陰性質(zhì)控的平均值，計算同一實驗里NC抗原的兩個陰性質(zhì)控的平均值，用WNRA/NCA，得出陰性質(zhì)控的ISR值。同樣地計算陽性質(zhì)控和樣品得ISR值，陽性質(zhì)控的ISR值應(yīng)高于3.0，陰性質(zhì)控的ISR值應(yīng)低于1.5。

ISR	結(jié)果	解釋
≤2.0	陰性	沒有檢測到IMM抗體
2.0－3.0	可疑	需確證實驗
≥3.0	陽性	存在IMM抗體，建議做確定性實驗

結(jié)果的判斷：

在某些特殊的例子中，曾報道有假陽性，但對梅毒病人無限制。假如樣品的ISR值大于2.0，但是WNRA和NCA的OD值均偏低，可視為潛在假陽性。以下為樣品1排除標準的范例。

排除標準：

計算陰性質(zhì)控的WNRA和NCA值：

	WNRA	NCA
	0.153	0.126
NO.2	0.125	0.110
總計	0.260	0.236

平均WNRA=0.260/2=0.130

NCA=0.236/2=0.118

ISR=0.130/0.118=1.10

任何陰性質(zhì)控的ISR值高于1.5，則實驗需要重做。

計算陽性質(zhì)控的WNRA和NCA值：

	WNRA	NCA
	0.635	0.190
NO.2	0.655	0.178
總計	1.290	0.368

平均WNRA=1.290/2=0.645

NCA=0.368/2=0.184

ISR=0.645/0.184=3.5

任何陽性質(zhì)控的ISR值低于3.0，則實驗需要重做。

以下標準是必需遵守的，不滿足以下標準，試劑出現(xiàn)了質(zhì)量問題或操作錯誤，實驗需重做。

因素	范圍
平均陰性質(zhì)控讀數(shù)	＜0.400
平均陽性質(zhì)控讀數(shù)	＞0.400
陽性質(zhì)控的ISR值	＞3.000
陰性質(zhì)控的ISR值	＜1.500

解釋結(jié)果

1. 樣品的ISR值大于3.0視為陽性。

2. 陽性結(jié)果需重做證明。

3. 樣品的ISR值小于2.0視為陰性。

4. 樣品的ISR值小于3.0但是大于2.0，視為未確定，但是很有可能陽性，實驗需一式三份重做。

5. ISR值大于2.0是因為WNRA和NCA的值都低造成的，應(yīng)該視為潛在假陽性。

樣品1低OD值的范例：
計算樣品的WNRA和NCA值：

	WNRA	NCA
	0.044	0.190
NO.2	0.016	0.007
總計	0.060	0.026

平均WNRA=0.060/2=0.030

NCA=0.026/2=0.013

ISR=0.030/0.013=2.31

雖然樣品的ISR值高于2.0，但是本樣品需視為假陽性，因為其OD值低，而且遠遠偏離了相關(guān)的標準品，這通常在空白值高的情況下發(fā)生。

要進一步證實樣品，所有陽性的結(jié)果都要用6，2層析稀釋滴定法重做，與相同滴定法的陰性質(zhì)控相比較，假如曲線是？？的，平的或者是波浪型的曲線，則表明為假陽性的結(jié)果。

實驗的局限性

1. 樣品的OD值高于抗原質(zhì)控（非WNRA）,導(dǎo)致ISR值小于3.0，則可能為假陰性，再釋稀樣品重新實驗，可能會獲得真正的ISR值。

2. 既然這不是一個直接檢測的方法，則需考慮假陽性和假陰性存在的可能性。

3. 所有有反應(yīng)的樣品，應(yīng)用確定性實驗來證實。

4. 本實驗提供的試劑，盡可能地檢測血清或血漿中的WNRA反應(yīng)性抗體水平。

5. 應(yīng)避免反復(fù)凍融樣品和試劑。

6. 不要使用溶血或脂血的樣品，它們會導(dǎo)致錯誤的結(jié)果。

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