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上海閃晶分子生物科技有限公司
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更新時(shí)間：2023-05-09 12:58:00瀏覽次數(shù)：224次
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主要用于對(duì) PCR 保真性要求較高的實(shí)驗(yàn)，如基因篩選、克隆表達(dá)、突變檢測(cè)、定點(diǎn)突變等等。
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Pfu酶用途
主要用于對(duì) PCR 保真性要求較高的實(shí)驗(yàn)，如基因篩選、克隆表達(dá)、突變檢測(cè)、定點(diǎn)突變等等。
Pfu酶特征
• 克隆有 Pyrococcus Furiosis DNA Polymerase 基因的大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，再經(jīng)三次過(guò)柱純化分離出來(lái)的一個(gè)約 90 KD 的重組蛋白。
• 具有 5' 到 3 ‘合成 DNA 的能力；有 3 '到 5 ‘外切酶的活性即糾錯(cuò)能力，通俗地說(shuō)，出錯(cuò)的機(jī)率是普通 Taq 酶的十分之一。為了減少由 3′-5′ 外切酶活性引起的引物降解，閃晶公司強(qiáng)烈推薦在冰浴上添加所有的試劑并且在溫度達(dá)到 60 -65°C 時(shí)再加入 Pfu DNA 聚合酶以便進(jìn)行熱啟動(dòng)或者在冰浴上添加試劑后放在預(yù)熱到 95°C 的 PCR 儀上。
• 無(wú) 5 ' 到 3 ‘外切酶的活性， 不能用于實(shí)時(shí)熒光PCR 。
• 無(wú) 3 ‘端加 A 的功能，產(chǎn)物為平端，如果需要做 T － A 克隆，需要做添 A 實(shí)驗(yàn)。
• 無(wú)外源核酸酶和細(xì)菌 DNA 污染。
• SDS － PAGE 檢測(cè)，純度＞ 95% 。
• 佳延伸溫度 72 ℃ ，佳 Mg 2+ 濃度 2.0mM ，佳 dNTPS 濃度 0.2mM ，延伸速度為 600base/min ； Pfu DNA 聚合酶比 Taq DNA 聚合酶的延伸反應(yīng)速率低，因此閃晶公司推薦延伸反應(yīng)時(shí)間為每 kb 需 2 分鐘。
• 10 × PCR buffer: 500mM KCl, 100mM Tris-HCl (pH 9.0 ， 25℃ ), 1% TritonX-100 和 20mM MgSO4 。
• Storage buffer: 20mM Tris-HCl (pH 8.0), 100mM KCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 50% 甘 油， 0.5% Nonidet -P40 和 0.5% Tween20 。
Pfu酶單位定義
在 74℃ 條件下， 30 分鐘內(nèi)催化 10nmol dNTP 的摻入反應(yīng)成為酸不溶性物質(zhì)所需的酶量為一個(gè)單位。反應(yīng)條件為： 50mM Tris-HCl (pH 9.0 ， 25℃ ), 50mM NaCl, 5mM MgCl2, 200mM dNTP( 含未標(biāo)記和標(biāo)記 [3H] dTTP ), 10mg 活化的小牛胸腺 DNA 和 0.1mg/ml BSA, 終反應(yīng)體積為 50ml 。
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