本試劑盒僅供研究使用

特異性：本試劑盒可檢測牛甘膽酸，且與其他相關物質(zhì)無交叉反應。
有效期：6個月
預期應用：ELISA法定量測定牛血清、血漿或其它相關生物液體中甘膽酸含量。
說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
3．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結果造成任何影響。
實驗原理
本試劑盒采用酶聯(lián)免疫間接競爭法檢測甘膽酸。微孔板上包被有甘膽酸偶聯(lián)物。加入甘膽酸抗體和甘膽酸標準品或樣品，游離甘膽酸與微量反應板上的甘膽酸結合物競爭結合抗甘膽酸抗體，沒有結合的抗體被洗去，再向微孔中加辣根過氧化物酶標記二抗，與結合在反應板上的抗體作用一定時間，洗去多余的辣根過氧化物酶標記二抗。再向反應孔中加入相應反應底物TMB，作用一定時間后，結合的酶結合物將TMB轉化為藍色，轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的甘膽酸呈負相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
1. 已包被甘膽酸偶聯(lián)物的酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）。
2. 標準品（Standard）：2×250ul/瓶。
3. 樣品稀釋液（Sample Diluent）：2×20ml/瓶。
4. 甘膽酸單克隆抗體：1×60μl/瓶（1：100）
5. 辣根過氧化物酶標記二抗（HRP-anti-antibody ）：1×120μl/瓶（1：100）
6. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
7. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
8. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
需要而未提供的試劑和器材
1. 標準規(guī)格酶標儀
2. 高速離心機
3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱
4. 超聲清洗器
5. 離子交換小柱（PCX）
6. 氮氣吹干儀
7. 干凈的試管和Eppendof管
8. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
9. 蒸餾水，容量瓶等
標本的稀釋原則：
首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標準曲線的范圍內(nèi)，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應做好詳細的記錄。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。
標準品的稀釋原則：2瓶，每瓶濃度為1000 ng/ml，以樣品稀釋液做系列倍比稀釋，分別稀釋1000 ng/ml，500 ng/ml，250 ng/ml，125 ng/ml，62.5 ng/ml，31.2 ng/ml，15.6 ng/ml。樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml。
甘膽酸抗體和辣根過氧化物酶標記二抗的稀釋原則：
臨用前以樣品稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（甘膽酸抗體每孔50ul，辣根過氧化物酶標記二抗每孔100ul），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10ul甘膽酸抗體和辣根過氧化物酶標記二抗加990ul樣品稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。
操作步驟
實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1. 酶聯(lián)板使用前用洗液洗板2-3次，每次浸泡1-2分鐘，250ul/每孔，甩干。
2. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00ul，余孔分別加標準品或待測樣品50ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，然后在所有孔中加入50 ul 膽酸抗體工作液。盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應30分鐘（為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液）。
3. 溫育后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，250ul/每孔，甩干。
4. 所有孔中加入100 ul辣根過氧化物酶標記二抗工作液。盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應30分鐘
5. 溫育后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，250ul/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，一般10-15分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標準品的后3-4孔有明顯的梯度藍色，前3-4孔顏色不明顯，即可終止）。
7. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。
注：
1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。
2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜。
4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、甘膽酸抗體和辣根過氧化物酶標記二抗工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品、甘膽酸抗體和辣根過氧化物酶標記二抗工作液。
5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算
以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
注意事項
1. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。
2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
3. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。
5. 如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
6. 在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。
7. 底物請避光保存。
8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。