一、原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物氨芐青霉素將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭氨芐青霉素抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物氨芐青霉素的含量成負相關，與標準曲線比較可得出相應殘留物氨芐青霉素的含量。
二、試劑盒特性
試劑盒靈敏度： 0.1ppb
樣本定量檢測下限
組 織——————————————— 2ppb
蜂蜜、牛奶—————————————2ppb
蜂蜜、牛奶樣本因存在一定的干擾，檢測下限為4ppb
交叉反應率
氨芐青霉素—————————————— 100%
青霉素————————0.8%
鄰氯青霉素—————————————— 0.2%
雙氯青霉素—————————————— 0.1%
阿莫西林—————————————— 0.1%
頭孢塞呋————————————————— 0.1%
樣本回收率
組 織——————————————75±10%
蜂蜜、牛奶————————————70±10%
三、 試劑盒組成
1、 微量測試孔：每條8孔，一板12條
2、 標準液×6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb
3、 酶標記物12ml………………紅色帽
4、 抗體工作液 7ml……………藍色帽
5、 底物 A 液 7ml……………白色帽
6、 底物B 液 7ml……………黑色帽
7、 終 止液 7ml ……………黃色帽
8、 20X濃縮洗滌液 40ml…………白色帽
9、 5X濃縮復溶液 50ml…………透明帽
四、所用儀器、試劑
具備的儀器：微孔板酶標儀、旋轉蒸發(fā)儀/氮氣吹干裝置、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
微量移液器：單道 20µl-200µl、100µl-1000µl、多道250µl
試 劑：
五、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
處理任何樣本時，都必須注意：
（a）本試劑盒所檢測的組織樣本包括：動物組織、禽類和水產組織。eg:雞、鴨、牛、羊、兔、魚、蝦等。
（b）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
（c）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。
樣本前處理需配制：
配液1、用去離子水將5×濃縮復溶液按1：4稀釋（1份濃縮復溶液+4份去離子水）用于樣本復溶與提取。
配液2、0.1M NaOH溶液
0.4gNaOH加去離子水100ml溶解。
配液3、乙腈-0.1MNaOH溶液
84ml乙腈和16ml 0.1M NaOH混合
均勻。
配液4、C液： 0.36M 亞硝基鐵
（Na2Fe（CN）5·NO·2H2O）10.7g亞硝
基鐵加入去離子水100ml溶解。
配液5、D液： 1M硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）
28.8g硫酸鋅加入去離子水100ml溶解。
配液6、1M NaOH 溶液
4gNaOH加去離子水100mL溶解。
（a）組織（雞、鴨、豬肉/豬肝、蝦、魚）前處理方法
1、 用均質器均質組織樣本；
2、 稱取2±0.05g于50ml離心管中，加入2ml 1M NaOH溶液，渦旋2min，再加入8ml乙腈振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min；
3、 取出1ml上清液于氮氣流下50～60℃*干燥；
4、 加入1 ml稀釋后的復溶液溶解干燥殘留物，混合30s；將溶解后的樣本液按1：3（50µl樣本液加150µl稀釋后的復溶液）稀釋，混合30s；
5、 取50 µl用于分析。
樣本稀釋倍數：20
（b）蜂蜜
1、 準確稱取1±0.05g蜂蜜樣本于離心管中，加入3ml 稀釋好的復溶液，振蕩混勻后靜置20min；室溫4000r/min 以上離心10min；
2、 取上層液體用稀釋好的復溶液按1：4（20µl樣本液+80µl稀釋后的復溶液）稀釋，混合30s；
3、 取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數：20
（c）牛奶
樣本處理方法一：
1、 取2ml鮮牛奶于5ml離心管，加入50µlC液混勻；
2、 加入50µl D液振蕩1min，10℃ 4000r/min以上離心10min；
3、 取上層清亮液體用稀釋好的復溶液按1:19（20µl樣本液+380µl稀釋后的復溶液）稀釋，混合30s；
4、 取50µl用于分析。
注：如果離心后仍然渾濁，再重復沉淀過程。
樣本稀釋倍數：20
樣本處理方法二：
1、 取2ml去除脂肪奶樣至離心管中；
2、 加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩5min，15℃ 4000r/min以上離心10min，取1ml上清液在60℃氮氣流下*干燥；
3、 用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml稀釋后的復溶液混合30s，離心去除正己烷相；
4、 取下層相用稀釋好的復溶液按1:3 （50µl樣本液加150µl稀釋后的復溶液）稀釋，混合30s；
5、 取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數：20
六、 酶標免疫分析程序
測定前應須知：
1、 使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。
2、 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
3、 在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4、 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。
操作步驟：
1、 從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
4、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號,每個樣本和標準品做2孔平行,并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
5、 加標準品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應30min。
6、 取出將孔內液體甩干，用洗液250µl/孔，洗板4-5次，每次間隔10秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7、 每孔加入酶標記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應30min。將孔內液體甩干，用洗滌液充分洗板4-5遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
8、 顯色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
9、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內讀完數據），測定每孔OD值。
七. 結果判定
結果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與氨芐青霉素的含量成負相關。
1、粗略判定
用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍（ppb）。假設樣本1的吸光度值為0.310，樣本2的吸光度值為0.820，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.610；0.1ppb為1.350；0.3ppb為1.030；0.9ppb為0.660；2.7ppb為0.389；8.1ppb為0.198。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb-8.1ppb；樣本2的濃度范圍是0.3 ppb-0.9 ppb。乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中氨芐青霉素實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值
（2）標準曲線的繪制與計算
以標準品百分吸光率為縱坐標，以氨芐青霉素標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中氨芐青霉素實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（索取）
八. 注意事項
1、 室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3、 試劑混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。
4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 試劑變質的跡象
顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm<0.5 ）時，表示試劑可能變質。
7、 加A、B 液后一般顯色15min即可，若顏色較淺，可延長顯色時間，但不能超過30min。
8、 該試劑盒*反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。
保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。
提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。
