大鼠胸大動脈平滑肌細胞 培養(yǎng)基的配制：

實驗步驟：在超凈臺內，安裝好濾器。

用去離子水溶解1640培養(yǎng)基，并用磁力攪拌器攪拌2 h，使之充分溶解。

在超凈臺內過濾。

分裝到250 mL的玻璃瓶內。

用封口膜封好，-20℃保存，過濾結束時，還要取少許培養(yǎng)基進行菌培，驗證培養(yǎng)基是否是無菌。

胎牛血清的處理：

沒有滅活的血清中含有補體成分，需要將血清在56℃條件下滅活30 min。在水浴鍋內進行，滅活的過程中，要不停地搖晃，使受熱均勻，防止沉淀析出來。

注意：

剛取出的凍存血清不要立即放入56℃中，因為突然的溫度升高會使裝血清的玻璃瓶破裂，應該放在室溫逐漸溶解，然后，再進行滅活處理。

生長培養(yǎng)基的配制：

90 mL IMDM中加入大約10 mL的胎牛血清（10% 左右），雙抗可以不加。

（有資料表明雙抗對細胞有一定的毒副作用）Hanks 和D-Hanks液，以及*的配制Hanks液是一種常用的*，D-hanks液是不含鈣鎂的Hanks液。它們與細胞的生長狀況下的pH值和滲透壓一致，細胞在Hanks液中可生存幾個小時，Hanks液主要用于清洗細胞。

D-Hanks液主要用于配制*。配制Hanks液需將CaCl2溶于蒸餾水，再將其它試劑配制成溶液，將兩次配制的溶液混合，定容。*是一種常用的細胞消化液，在原代培養(yǎng)時，用*消化，使細胞從組織塊中游離出來。

傳代培養(yǎng)時，用*消化貼壁的細胞，并分散成單個細胞。

*分離細胞的能力與不僅與*作用的溫度、時間、濃度和pH有關，還與細胞的類型和特性有關。

用于原代培養(yǎng)消化組織塊采用的濃度為：0.1% 或 0.125%；

用于傳代培養(yǎng)采用的*濃度為：0.25%或者0.2%。

*的配制：

1）由于*的作用主要機制是通過螯合鈣鎂離子，而鈣鎂離子是保持細胞和細胞之間相互連接所必需的，所以，*的配制用無鈣鎂的D-Hank液，避免鈣鎂離子干擾*的活性。

2）*在pH8.0時活性zui強，在過濾除菌前，須用NaHCO3干粉調溶液的pH值。

3）*受熱容易分解，所以避免盛夏配制，在配制過程中，溫度保持在4℃，zui后-20℃凍存。反復凍溶會影響*的活性，要分裝凍存。

4）血清能降低*的活性，所以，在終止*的消化反應時，可加入含有血清的培養(yǎng)基。

[實驗步驟]

配制Hanks液，高壓滅菌，4℃保存。稱取*，在冰浴上進行研磨，并加入少量的D-Hanks液，使其呈糊狀，zui后用D-Hanks定容，過濾除菌。

分裝后，-20℃保存。

細胞傳代培養(yǎng)[實驗步驟]

1、準備工作：

1）肥皂洗手，在進行無菌操作前，用75% 的酒精擦拭雙手，注意指間，和指甲周圍。同時，用酒精棉球擦拭超凈臺。

2）將培養(yǎng)液放置室溫，備用。

3）打開超凈臺內的紫外燈，照射20 min。同時，將實驗所需材料也放入超凈臺進行滅菌（血清、培養(yǎng)基除外）

4）倒置顯微鏡下，觀察細胞的狀態(tài)，是否已經(jīng)長滿培養(yǎng)瓶，需要進行分瓶。

2、關閉超凈臺的紫外燈，打開風機。

3、點燃酒精燈，取出刻度吸管，在火焰上略燒，然后，安上吸球待用。

4、在打開培養(yǎng)瓶之前，用酒精棉球擦拭瓶蓋，打開后，瓶口在酒精燈上過火焰，再用吸管輕輕吸出舊的培養(yǎng)液，注意，吸管不要碰到布滿細胞的培養(yǎng)瓶的側壁。

5、將*加入培養(yǎng)瓶內,顯微鏡下隨時觀察，見到細胞的突起消失，變圓時，立即翻轉培養(yǎng)瓶，吸出*。記住不要消化時間過長，否則，細胞會被*消化掉。

6、加入適量Hanks液或培養(yǎng)基清洗一遍，立即倒掉。

7、加入含有10%血清的培養(yǎng)基，用吹打管吹打，一定要輕輕吹打，使其從瓶壁上脫落分散到培養(yǎng)基中，再補加培養(yǎng)基，按1:3進行分瓶。

然后，用火焰燒培養(yǎng)瓶的瓶口和蓋，再蓋好培養(yǎng)瓶的蓋，放到培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

以上介紹的是貼壁細胞的傳代培養(yǎng)方法，對于懸浮細胞的傳代培養(yǎng)方法，只需要將細胞進行離心，1000 rpm，5 min,然后，換入新的培養(yǎng)基即可。

再分裝到不同的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。

不健康的細胞質中有空泡，細胞內有顆粒樣物質，細胞間空隙增大，變形，不規(guī)則，失去原有的特點。

是否污染：

傳代或換液24~ 48 h注意觀察細胞是否被污染，污染的細胞培養(yǎng)液變渾濁，鏡下可見有大量菌絲。如果細胞生長緩慢，生長特性改變，胞質內顆粒性物質增多，盡管培養(yǎng)液不變渾濁，考慮可能有支原體污染。污染的細胞立即從培養(yǎng)箱中取走，以免污染其它細胞。

實驗四、

細胞凍存與復蘇[實驗步驟]

1. 為了保證細胞良好的狀態(tài)，在細胞凍存的前一天使細胞處于對數(shù)增長期，同時將細胞換液，次日，按照細胞傳代培養(yǎng)方法，用*消化貼壁細胞，將細胞用培養(yǎng)基沖下來，然后，用50 mL尖底離心管離心，1000 rpm，4min，棄上清，收集細胞。

2. 加入適量的凍存液（10% DMSO 和 90%含有20%血清的IMDM培養(yǎng)基）

3. 分裝到凍存管中，做好標記，標明細胞名稱，保存時間，所用培養(yǎng)基等。

4. 4℃放置30 min；-20℃放置1.5 h； -70℃放置12 h；zui后移到液氮罐中。

細胞的復蘇：細胞的復蘇原則是快速溶化，因為如果緩慢的溶化，會使進入細胞的水分形成冰晶，對細胞造成傷害，因此，在復蘇細胞時，將凍存細胞直接放到37℃的水浴中，使其迅速溶解。在超凈臺內將凍存管內的細胞懸浮液直接倒入小培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內，然后，加入3 mL的培養(yǎng)液。次日，觀察細胞生長情況，并更換細胞培養(yǎng)液。