支原體污染檢測(cè)試劑盒（PCR法）

（PCR Mycoplasma Detection Kit）

Cat number：YS012

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Expire date：

For Research Use Only

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一、 試劑盒說(shuō)明

本試劑盒通過(guò)PCR法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物、動(dòng)物分泌物等多種生物材料進(jìn)行支原體污染檢測(cè)。常規(guī)培養(yǎng)法進(jìn)行支原體檢測(cè)一般需要幾天的時(shí)間，而本試劑盒通過(guò)PCR擴(kuò)增及電泳分析進(jìn)行支原體檢測(cè)只需幾個(gè)小時(shí)，方便快捷。本試劑盒的多對(duì)引物能特異性擴(kuò)增多種支原體rRNA基因片段，一次就可以檢測(cè)至少11種的支原體，包括M. fermentans，M. hyorhinis，M. arginini，M. orale，M. salivarium，M. hominis，M. pulmonis，M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyponeumoniae, M. capricolum 等。其原理是原核生物的rRNA堿基序列非常保守，而rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區(qū)如16S和23S間隔區(qū)，各種生物種間的堿基序列差別很大。這個(gè)間隔區(qū)的DNA序列及長(zhǎng)度在支原體各個(gè)種間既有相對(duì)保守的部分，也有具有很大差異的部分。因此可以在編碼16S和23S rRNA的DNA上設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增編碼16S和23S rRNA的DNA間隔區(qū)，然后在編碼16S和23S rRNA的DNA間隔區(qū)的保守區(qū)上設(shè)計(jì)一條引物，在編碼23S rRNA的DNA上設(shè)計(jì)一條引物進(jìn)行嵌套式PCR。能特異性檢測(cè)出支原體DNA，檢測(cè)靈敏度與特異性都很高。

二、試劑盒組份

三、試劑盒以外自備儀器和試劑

離心機(jī)、微量移液器、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、dNTPs（10mM）、瓊脂糖、溴化乙錠等

四、使用注意事項(xiàng)

整個(gè)實(shí)驗(yàn)，應(yīng)規(guī)范操作，反應(yīng)體系的配制、樣本處理及加樣、PCR擴(kuò)增應(yīng)分區(qū)域進(jìn)行，以避免交叉污染。

五、 操作方法

1.收取待檢樣品（細(xì)胞一般生長(zhǎng)至80％左右即可，貼壁細(xì)胞不宜用消化液消化細(xì)胞，可以使用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞），然后取細(xì)胞懸液200ul（約1～3×105細(xì)胞數(shù)）至離心管，12000rpm離心5～10min；去上清，加入50ul DNA溶解液，充分懸浮沉淀物，沸水浴5min；樣品使用前12000rpm離心5～10min，取上清4ul作為PCR反應(yīng)模板；剩余樣品可以-20℃保藏。樣本有時(shí)也可以直接用污染液直接做PCR反應(yīng)。

2.PCR反應(yīng)

*步PCR：

50μL體系PCR反應(yīng)（如客戶需要使用更小量的反應(yīng)體系，試劑加樣量按比例進(jìn)行減少）：

（1）．使用前每個(gè)組份輕輕混勻，然后2000rpm離心20s；

（2）．取滅過(guò)菌的0.2mL離心管，在冰上依次加入

10×Taq Buffer                   5  μL

dNTPs （10mM）                  1  μL

MgCl2 （25mM）                  4  μL

Myc F1 （10μM）                 1  μL

Myc R1 （10μM）                 1  μL

DNA樣品                      1~5 μL

Taq DNA Polymerase             0.5 μL

ddH2O up to                     50 μL

（3）．輕輕混勻，2000rpm離心20s；

（4）．進(jìn)行PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增條件：

94°C，5min；

94°C，30 sec；55°C，2min；72°C，1 min；32 Cycles；

72°C，10 min，

第二步PCR：

50μL體系PCR反應(yīng)（如客戶需要使用更小量的反應(yīng)體系，試劑加樣量按比例進(jìn)行減少）：

（1）．使用前每個(gè)組份輕輕混勻，然后2000rpm離心20s；

（2）．取滅過(guò)菌的0.2mL離心管，在冰上依次加入

10×Taq Buffer                   5  μL 

dNTPs （10mM）                  1  μL

MgCl2 （25mM）                  4  μL

Myc F2 （10μM）                 1  μL

Myc R2 （10μM）                 1  μL

*步產(chǎn)物                    1~5 μL

Taq DNA Polymerase             0.5 μL

ddH2O up to                     50 μL

（3）．輕輕混勻，2000rpm離心20s；

（4）．進(jìn)行PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增條件：

94°C，5min；

94°C，30 sec；55°C，2min；72°C，1 min；32 Cycles；

72°C，10 min，

3.反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液10μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)PCR反應(yīng)產(chǎn)物。如果此PCR產(chǎn)物需用于以后實(shí)驗(yàn)，應(yīng)將PCR產(chǎn)物冷凍保存。

4.根據(jù)感染支原體類型的不同，擴(kuò)增產(chǎn)物大小有所不同，*步PCR產(chǎn)物在350～700bp 之間，第二步PCR產(chǎn)物在150～250bp之間。