如何進(jìn)行細(xì)胞染色

I.細(xì)胞的染色例

1. 染色例1

以染色HeLa細(xì)胞為例，介紹使用如下試劑的方法

1）. 試劑溶液的配制

配制以下的儲(chǔ)備液

Calcein-AM 0.5 mg/ml DMSO solution

BCECF-AM 1 mmol/l DMSO solution

CFSE 1 mg/ml DMSO solution

CytoRed 1 mmol/l DMSO solution

FDA 0.5 mg/ml DMSO solution

PI 1 mg/ml H2O solution

EB 1 mg/ml H2O solution

DAPI 1 mg/ml H2O solution

AO 1 mg/ml H2O solution

* DMSO solution在-20℃的條件下保存,避免失效

2）. 器具

蓋玻片 18 mm × 18 mm

培養(yǎng)皿 （直徑約35 mm）

鑷子

3）. 操作

1） 用5.0 ml PBS（-）溶解10 μl儲(chǔ)備液，配制成染色液。

*由于用DMSO溶解的儲(chǔ)備液在水溶液中易分解，所以染

色液要現(xiàn)配現(xiàn)用，放置長(zhǎng)時(shí)間后不能染色。

2） HeLa細(xì)胞用Trypsin-EDTA制成細(xì)胞懸液。

3） 將細(xì)胞懸液離心分離（速度: 1,000 rpm，時(shí)間: 3分鐘）。

4） 去除上清液，加入PBS（-），控制細(xì)胞數(shù)量在105-106 個(gè)/ml。

5） 用移液槍吹打充分。

6） 在1.5ml微管中加入30 μl第4） 步得到的細(xì)胞懸液。

7） 加入15 μl染色液。

8） 蓋上蓋子，在37℃的條件下，孵育15-30分鐘。

9） 取10 μl第8） 步的染色溶液滴加在蓋玻片上， 上面再覆蓋

另一張蓋玻片。

10） 將蓋玻片放在熒光顯微鏡下，用染色試劑對(duì)應(yīng)的激發(fā)波

長(zhǎng)觀察。

2. 染色例2

以MitoRed染色細(xì)胞為例，介紹使用如下試劑的方法

1）.試劑溶液的配制

配制以下的儲(chǔ)備液

MitoRed 1 mmol/l DMSO solution

（用78 μl DMSO溶解1支50 μg的MitoRed）

*DMSO solution在-20℃的條件下保存，避免失效

2）. 操作

1） 用培養(yǎng)基稀釋1 mmol/l 儲(chǔ)備液。MitoRed終濃度為：20-

200 nmol/l

*加入到細(xì)胞前，推薦先在37℃保溫

2） 在細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)細(xì)胞 （細(xì)胞濃度：1×105- 1×106個(gè)

/ml）。

3） 去除培養(yǎng)基，用 （培養(yǎng)基：PBS，Hank,s溶液等）輕輕

地清洗。

4） 將稀釋的試劑溶液添加至每孔，在培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)

30-60分鐘。

5） 去除含色素溶液的培養(yǎng)基，添加新的培養(yǎng)基。

6） 用熒光顯微鏡觀察。

固定細(xì)胞的時(shí)候，在第4） 步的操作后按以下步驟操作。

5） 去除MitoRed溶液，用不含血清的培養(yǎng)基， PBS，

Hank,s溶液清洗。

6） 用10%中性 福爾馬林緩沖液，固定15-20分鐘。

7） 用PBS清洗。

8） 用熒光顯微鏡觀察。

圖P-7-1 j） 染色HeLa細(xì)胞的熒光圖像。

3. 染色例3

介紹以Hochest 33258,33342染色細(xì)胞為例

1）. 試劑溶液的配制

配制以下的儲(chǔ)備液

Hochest 33258 1 mg/ml H2O solution

Hochest 33342 1 mg/ml H2O solution

細(xì)胞固定液：1%戊二醛/PBS（-）

培養(yǎng)液：PBS（-）

2）. 操作

1） 將含約1×106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基離心5分鐘

（速度：400 x ），去除上清液。

2） 加入100 μl細(xì)胞固定液，采用吹打等方法，充分混合。

3） 在室溫下靜置30分鐘。

4） 離心5分鐘 （速度：400 x ），去除上清液。加入1 ml

PBS（-）混合后，再離心5分鐘 （速度：400 x ）。

*此操作為了充分清洗掉戊二醛，如果存在戊二醛，會(huì)導(dǎo)致淬滅。

5） 加入20 μl PBS （-），混合后加入4 μl熒光色素，再混合。

6） 滴1滴細(xì)胞染色液在載玻片上，將蓋玻片蓋在上面。

7） 用熒光顯微鏡觀察。

圖P-7-1 k）、I）染色正常人胎兒細(xì)胞的熒光圖像。