許多蛋白質(zhì)在合成后可進一步修飾。通常是加上糖基、磷酸根或硫酸根。這些修飾有多種用途，包括作為特殊的胞內(nèi)或胞外轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的標(biāo)記蛋白、幫助特異蛋白質(zhì)的折疊優(yōu)化或作為調(diào)控元件改變靶底物的關(guān)鍵特性。利用修飾基團的特異性放射前體標(biāo)記細(xì)胞，然后進行免疫沉淀即可分辨出翻譯后修飾了的蛋白質(zhì)。
雖然有數(shù)百種不同的翻譯后修飾，但許多修飾不能用特異的放射活性前體進行研究。因為從商業(yè)角度考慮，并不總是能得到正確的前體。前體亦不能被細(xì)胞攝取，或細(xì)胞內(nèi)池不夠大，不能得到具有高特異性的活性分辨基團等。然而，仍有很多修飾過程可用此法研究。
通過免疫沉淀／免疫印跡檢測*磷酸化
蛋白質(zhì)在*殘基上的磷酸化能通過抗磷酸*的抗體來檢測。直接從未標(biāo)記的細(xì)胞中通過免疫沉淀抗原可以檢測其*磷酸化，通過SDS-PAGE將免疫沉淀的蛋白質(zhì)分離，使用常規(guī)的免疫印跡法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。使用磷酸化*的特異性抗體進行免疫印跡。
糖基化
在研究蛋白質(zhì)的糖基化時，使用特異性抗體通過免疫沉淀相應(yīng)的抗原是極為有用的方法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在SDS-PAGE中遷移時，首先要注意的就是糖基化。免疫沉淀下來的蛋白質(zhì)如果被糖基化，則計算出的分子質(zhì)量就比預(yù)計的大30％～50％，而且條帶會變寬。糖基化對細(xì)胞有多種作用，但主要是作為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運的特殊步驟中的標(biāo)記蛋白，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變可導(dǎo)致其活性改變?；蛱峁┘?xì)胞外的結(jié)合區(qū)，從而對細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)及組織發(fā)育發(fā)揮作用。
按照與多肽連接的不同可將糖基化分為兩種形式。N端糖基化通常將一個糖基，幾乎都是N—乙酰半乳糖胺，與天冬酰胺的氨基基團相連，O端糖基化可將多種糖與*的羥基相連。蛋白質(zhì)很少被單個糖基修飾。糖基化難以研究的原因在于糖鏈上有許多不同的糖基，多糖骨架中糖基的順序也不同，而且側(cè)鏈的延伸與分支存在多樣性。
研究蛋白質(zhì)的糖基化有兩種常用的方法：①以放射性單糖標(biāo)記細(xì)胞，使其被攝取后加在糖骨架上；②以特異性的化學(xué)試劑或酶裂解成分處理純化的多肽，去除部分或全部的糖基。特異性抗體有助于兩種過程的實施。在標(biāo)記的單糖發(fā)揮作用之后，將蛋白質(zhì)沉淀并通過SDS-PAGE分離，然后檢測其放射活性。摻有[32S]標(biāo)記的蛋氨酸或其他氨基酸的蛋白質(zhì)可進行免疫沉淀，然后以化學(xué)的或酶裂解成分處理或不加處理，通過SDS-PAGE分離后檢測活性的改變?；罴?xì)胞用[3H]半乳糖或[3H]甘露糖進行放射標(biāo)記，標(biāo)記時間應(yīng)較短，不超過1h，因為多糖可很快參與多種不同的生物合成途徑，含糖復(fù)合物以外的其他大分子中也可標(biāo)記。斷裂也是問題，因為沒有簡單的方法可破壞所有的糖基化或全部的N端糖基化或O端糖基化。多肽—N糖基酶F常被用來裂解N端糖基，它可以斷裂大部分的N端糖基。其他常用的酶包括內(nèi)源性糖苷酶H和內(nèi)源性糖苷酶F。盡管從技術(shù)上講化學(xué)裂解較為復(fù)雜，但許多研究者認(rèn)為一旦在實驗室建立該方法，便更可靠有效。zui常用的化學(xué)裂解物是無水氟甲噻嗪。如需獲得上述問題更詳細(xì)的資料，讀者可參閱Vavki（1994）的放射標(biāo)記法和細(xì)胞生物學(xué)新進展。
烯化
已知細(xì)胞中0．1％一0．5％的蛋白質(zhì)可加上類異戊二烯進行修飾。用作蛋白質(zhì)修飾的類異戊二烯有farnesyl和geranylgeranyl基團。這些疏水性成分常用來將蛋白質(zhì)錨著在脂質(zhì)膜上。常修飾的是羧基端的半*殘基，通過巰基酯相連。
采用[3H]代謝標(biāo)記類異戊二烯的前體物甲羥戊酸（mevalonate）可檢測烯化，有4種不同的標(biāo)記方法可供選擇。早期實驗采用在相對低水平的結(jié)合培養(yǎng)基中加入高水平[3H]—甲羥戊酸（>500uCi／m1）。阻斷甲羥戊酸的內(nèi)源性合成有助于其摻入。在細(xì)胞內(nèi)HMGCoA在HMGCoA還原酶的作用下，生成甲羥戊酸。在代謝標(biāo)記實驗中，抑制HMGCoA還原酶，可減慢此合成反應(yīng)，增加[3H]—甲羥戊酸摻入到farnesyl和geranylgeranyl基團的前體物中的量。HMGCoA還原酶的特異性藥物（mevinnolin）使此步得以實施。第三種變化是增加甲羥戊酸的轉(zhuǎn)運率，甲羥戊酸的轉(zhuǎn)運體zui近已被克隆，并且可轉(zhuǎn)入待檢測的細(xì)胞中。此外，少數(shù)細(xì)胞系具有選擇性高水平轉(zhuǎn)運能力， 目的基因可轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞來研究烯化作用。
硫酸化
許多細(xì)胞外蛋白可通過加入硫酸后被修飾，zui有特點的是葡萄糖氨基酸多糖（glycosaminoglycans），如肝素硫蛋白多糖和粒素（granins）。將生長的細(xì)胞置于含有[35S]標(biāo)記的硫酸，而不含未標(biāo)記硫酸鹽（MgCl2取代MgS04）的少量培養(yǎng)基中，可以檢測硫酸化過程。如果需要加入血清，用透析和雙重濾過除菌的樣本去除培養(yǎng)基中的硫酸。放射性標(biāo)記硫酸鹽的終濃度應(yīng)接近0．5uCi／m1。標(biāo)記時間應(yīng)該比肽鏈延長的時間稍短。對于仍處于分泌途徑中的蛋白質(zhì)，標(biāo)記時間不應(yīng)超過5min，對已分泌的蛋白質(zhì)和胞外的基質(zhì)蛋白，通常要孵育標(biāo)記30～60min。
分泌蛋白可直接從培養(yǎng)基中通過免疫沉淀進行標(biāo)記，胞內(nèi)蛋白在洗滌細(xì)胞和用裂解緩沖液處理后可釋放出來，然后采用常規(guī)的標(biāo)記方法進行免疫沉淀。通過放射自顯影或磷光成像儀檢測SDS-PAGE上硫標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
