細(xì)胞凋亡檢測可以：（1）用于腫瘤細(xì)胞和組織在內(nèi)的不同種類病理標(biāo)本研究；（2）應(yīng)用于臨床診療，新藥研制、生物制品開發(fā)、腫瘤放*、以及從促凋亡角度探索腫瘤的基因治療；（3）對相關(guān)疾病的早期發(fā)現(xiàn)、放*的療效評價具有舉足輕重的地位。

實驗方法原理

本實驗用1μg/ml 三尖杉酯堿HT在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時也有少數(shù)細(xì)胞發(fā)生壞死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）對細(xì)胞進(jìn)行雙重染色，可以區(qū)別凋亡、壞死及正常細(xì)胞。

三尖杉酯堿（HT）是我國自行研制的一種對急性粒細(xì)胞白血病，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內(nèi)作用2小時，即可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。

細(xì)胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿過質(zhì)膜。當(dāng)細(xì)胞壞死時，質(zhì)膜不完整，PI就進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，它可嵌入到DNA或RNA中，使壞死細(xì)胞著色，凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞不著色。而一些活細(xì)胞染料由于為親脂性物質(zhì)，可跨膜進(jìn)入活細(xì)胞，因而可進(jìn)行活細(xì)胞染色。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較弱，它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與DNA特異結(jié)合（主要結(jié)合于A-T）堿基區(qū)），顯示凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞。凡是看到有凋亡小體的細(xì)胞都是凋亡細(xì)胞。

實驗材料

人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞

試劑、試劑盒

三尖杉酯堿Tris-HclEDTA緩沖液堿性裂解液SDS醋酸鈉異丙醇乙醇溴酚藍(lán)蔗糖指示劑TBE電泳緩沖液瓊脂糖溴乙錠PI母液Ho33342母液

儀器、耗材

熒光顯微鏡電泳儀電泳槽微量加樣器離心管載玻片蓋玻片

實驗步驟

一、試劑準(zhǔn)備 
 

1.  三尖杉酯堿（HT）：300μg/ml；

2.  Tris-HCl（pH7.5）：100mmol/L；

3.  EDTA緩沖液：5mol/L；

4.   堿性裂解液：0.2mol/L NaOH；

5.  醋酸鈉：3mol/L KAc（pH4.8）；

6.  PI母液：500μg/ml；

7.  Ho33342母液：2mmol/L；

8.  人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞：用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃，5% CO₂條件下培養(yǎng)。

9.  其他：異丙醇、1%SDS、70%乙醇、溴酚藍(lán)、蔗糖指示劑、TBE電泳緩沖液、1%瓊脂糖、溴乙錠。

二、三尖杉酯堿誘發(fā)HL-60細(xì)胞凋亡

1.  實驗前約24小時，接種兩瓶HL-60細(xì)胞，標(biāo)記①、②，每瓶含約6 ml培養(yǎng)液，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.  實驗前約2.5小時，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%，①號瓶加入三尖杉酯堿200 μl，使終濃度為1 μg/ml，②號瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作對照。共同放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2.5小時。

3.  Ho33342和PI雙重染色鑒別三種細(xì)胞

（1）染色：將瓶中的細(xì)胞搖勻取200 μl于1.5 ml的離心管中，加入Ho33342母液2 μl，PI 20 μl，染色15分鐘。

（2）滴片：取一載玻片用雙面膠圍成一小室，從離心管中各取以上染色后的細(xì)胞懸液10 μl，加入小室內(nèi)蓋上蓋玻片，熒光鏡下用紫外激發(fā)光，高倍鏡下觀察，區(qū)別三種細(xì)胞，并注意三者比例。