1 添加保護堿基的目的

在分子克隆實驗中，有時我們會在待擴增的目的基因片段兩端加上特定的酶切位點，用于后續(xù)的酶切和連接反應。但實驗證明，大多數(shù)限制酶對裸露的酶切位點不能切斷。必須在酶切位點旁邊加上一個至幾個保護堿基，才能使所定的限制酶對其識別位點進行有效切斷。因此在設計PCR 引物時，為保護5` 端外加的內切酶識別位點，人為地在酶切位點序列的5‘端外側添加額外的堿基序列，即保護堿基，用來提高酶切時的活性，使酶切*。

2首先要明確什么是保護堿基

限制性內切酶 識別特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白還要占據(jù)識別位點兩邊的若干個堿基，這些堿基對內切酶穩(wěn)定的結合到DNA雙鏈并發(fā)揮切割DNA作用是有很大影響的，被稱為保護堿基。

3添加保護堿基的原則

添加保護堿基，需要考慮兩個因素：一是堿基數(shù)目，一是堿基種類。

添加保護堿基時，zui關心的應該是保護堿基的數(shù)目，而不是種類。什么樣的酶切位點，添加幾個保護堿基，是有數(shù)據(jù)可以參考的。

一般情況下，普通的內切酶只加入兩個保護堿基，其內切反應就可以正常進行;而有一類，僅僅只加入兩個保護堿基，其內切反應就不能正常進行，這是因為內切酶不能正常結合DNA段上。如NdeI就屬這類，需要加入至少6個保護堿基，常用的HindIII也要三個。

添加什么保護堿基，如果嚴格點，是根據(jù)兩條引物的Tm值和各引物的堿基分布及GC含量。如果某條引物Tm值偏小，GC%較低，添加時多加G或C，反之亦反。

為了解不同內切酶對識別位點以外zui少保護堿基數(shù)目的要求，NEB采用了一系列含識別序列的短雙鏈寡核苷酸作為酶切底物進行實驗。實驗結果對于確定雙酶切順序將會有幫助（比如在多接頭上切割位點很接近時），或者當切割位點靠近DNA末端時也很有用。在本表中沒有列出的酶，則通常需在識別位點兩端至少加上6個保護堿基，以確保酶切反應的進行。

4當在引物5’端添加酶切位點時要考慮：

a）該目的序列內部不得含有相同的酶切位點，這樣的錯誤會給將來的克隆 造成麻煩。

b）如果打算PCR 后直接酶切，不要忘了在酶切位點的外側再加上保護堿基，不同的酶對于保護堿基的要求是不同的。

如果不設計保護堿基，則多半要用TA 克隆的方式連接到質粒上，這時要注意Taq 酶的選擇，若想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。

當計算引物Tm 值時并不包括這些序列，但是應該對其進行互補性和內部二級結構的檢測。