帶有校正功能的酶
包括克隆和效率分析,PCR產(chǎn)物表達(dá)或定點(diǎn)突變?cè)趦?nèi)的PCR應(yīng)用都需要高忠實(shí)性的PCR。Taq dna聚合酶被看做是低忠實(shí)性的聚合酶,因?yàn)槠淙鄙?’到5’外切核酸酶(校正)活性。
使用帶有3’到5’外切核酸酶活性的熱穩(wěn)定聚合酶可以提高忠實(shí)性。
但是這些聚合酶的產(chǎn)量比taq DNA聚合酶低。Platinum Pfx DNA聚合酶明顯比Taq DNA聚合酶忠實(shí)性高,而且?guī)в蠵latinum產(chǎn)品產(chǎn)量和特異性高的優(yōu)點(diǎn)(圖25)。
使用人thrombospondin的1.1kb片段的探針對(duì)基因組DNA(泳道1到6分別為100,50,10,5,1和0ng)擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。A組,使用1單位Platinum Pfx Taq DNA聚合酶,在室溫配制反應(yīng)液。B組,使用2.5單PfuTurbo™ DNA聚合酶,在冰上配制反應(yīng)液。C組,使用1單位Taq DNA聚合酶,在冰上配制反應(yīng)液。
酶混合物
將Taq DNA聚合酶同帶有3’到5’外切核酸酶活性第二種聚合酶混合在一起可以獲得比單獨(dú)Taq DNA聚合酶高的忠實(shí)性,并可以得到高產(chǎn)量及擴(kuò)增長(zhǎng)模板。Gibco BRL高保真酶混合物,Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity忠實(shí)性是單獨(dú)Taq DNA聚合酶的6倍,并可以zui高擴(kuò)增到12kb。
其他參數(shù)
除了酶,高濃度的dNTP或鎂離子會(huì)降低忠實(shí)性。將dNTP的濃度從200μM降低到25-50μM可以增加度。如果四種核苷的濃度不同,忠實(shí)性會(huì)受影響。進(jìn)行較少的PCR循環(huán)也會(huì)有助于增加忠實(shí)性,因?yàn)樵黾友h(huán)數(shù)目和產(chǎn)物長(zhǎng)度就會(huì)增加突變可能性。