儀器用具：

37℃培養(yǎng)箱及冰浴

Electroporation cuvette （electrode gap, 0.1 cm）

Electroporator （Bio-Rad, IBI geneZapper 或其它廠牌）

藥品試劑：

無菌水 （置冰浴中）

10% glycerol （置冰浴中）

SOB 液體培養(yǎng)基

SOB 固體培養(yǎng)基

SOC 液體培養(yǎng)基

SOC/Amp 固體培養(yǎng)基

大腸桿菌JM109

Ligation mixtures

方法步驟：

菌體的處理：

1） 進(jìn)行轉(zhuǎn)形實(shí)驗(yàn)的前16~20 h,將菌種JM109 接種在SOB 固體培養(yǎng)基上，并在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

34 Methods in Biotechnology Vol 1

2） 取80 mL SOB培養(yǎng)基裝入250 mL滅過菌的三角瓶。 另取1 mL SOB加于微量離心管中。由SOB固體培養(yǎng)基上選8 個(gè)約2~3 mm大小的單一菌落接入1mL SOB中，震蕩將菌體打散后，加入80 mL SOB中，于37℃震蕩培養(yǎng)約2~3h,直至細(xì)胞數(shù)約為4~7×107/mL.

3） 收集菌液于離心管中，置冰浴中10 min.

4） 以750~1,000 g 離心12~15 min （4℃）。

5） 倒去上清，并盡量將液體倒干，或以微量移液器頭吸干凈。

6） 沉淀加入80 mL 冰冷的無菌水，稍加震蕩，混合均勻后以750~1,000 g 離心12~15 min （4℃）。

7） 倒去上清，菌體再依序以40 mL 及1.6 mL 無菌水同法處理。

8） 菌體以0.16 mL 冰冷的10% glycerol 懸濁。

9） 菌液每80 μL分裝一管，可直接用于electroporation,或以液態(tài)氮或干冰快速凍結(jié)后置 -70℃貯存。

Electroporation:

1） 進(jìn)行electroporation 的DNA 樣品溶液中離子強(qiáng)度不可過高，DNA 需先經(jīng)過透析或以酒精沉淀處理。透析可如2.3.1 節(jié)步驟15） 進(jìn)行。

2） Cuvettes 自包裝中取出后，置冰浴中至少5 min.

3） 將菌液置于冰浴中，加入DNA 樣品，混合后，小心將溶液吸至cuvette 的凹槽中，將cuvette 置冰浴中。

4） 進(jìn)行electroporation 時(shí)，將cuvette 由冰浴中取出，將四周水份擦干，置于反應(yīng)槽中，并接上電極線。

5） 以2.5 kV, 21 μF 進(jìn)行electroporation.

◆ 注意!高電壓!

6） 取出cuvette，立即加入1 mL SOC.

7） 吸出菌液移至微量離心管中，于37℃震蕩培養(yǎng)45 min.

8） 取200 μL 菌液涂布于SOC/Amp plate.置37℃培養(yǎng)16~20 h.

9） 觀察plate 上菌落的形狀并計(jì)算菌落數(shù)。