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心肌成纖維細胞的培養(yǎng)

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用Langendorff灌流消化(膠原酶II)只能取得心肌細胞。建議直接將心臟剪碎,成纖維細胞我們這里一般采用0.05%消化。無菌條件取出心臟D-hank's液(PBS也可)漂洗,剪碎心臟加入5倍體積消化液,37C水浴3-5min,反復(fù)吹打,靜置,待自然沉降后棄去上清液。剩余沉淀再加入約5倍體積0.08%及0.1%膠原酶II混合液,反復(fù)吹打,大約10分鐘(消化時間往往靠經(jīng)驗的判斷),離心取沉淀重懸于含20%BSA的DMEM(有條件可以用Cascade的培養(yǎng)液)。60-90min后更換培養(yǎng)液(差速貼壁,成纖維細胞比心肌細胞貼壁快)。

1、的作用比較強烈,聯(lián)合使用膠原酶將膠原纖維充分消化后利于離心時細胞沉淀,提高細胞存活率。另外,消化時間不宜太長,主要憑觀察和經(jīng)驗來判斷。離心采用1000rpm 5min。

2、酶的配置可以用d-Hank's液或生理鹽水都行。血清的作用主要是終止消化,用一般加了血清的DMEM就行,我們這里是20%胎牛血清。

3、貼壁時間:我?guī)熜衷?jīng)告訴我2hr,現(xiàn)在我覺得90min已經(jīng)很好了。

4、細胞可以先用臺盼藍測定存活率。

5、鑒定:在倒置顯微鏡下觀察,細胞呈梭形、多角形,細胞質(zhì)透明,細胞核大,呈橢圓形,常含有2-3 個核。IHC可以用I抗體(動物抗人B3、抗波形蛋白、抗血管平滑肌肌動蛋白)其余基本按IHC的步驟來

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