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如何進行細胞分離技術

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一、離心技術

離心是研究如細胞核、線粒體、高爾基體、溶酶體和微體,以及各種大分子基本手段。一般認為,轉(zhuǎn)速為10~25Kr/min的離心機稱為高速離心機;轉(zhuǎn)速超過25Kr/min,離心力大于89Kg者稱為超速離心機。目前超速離心機的zui高轉(zhuǎn)速可達100Kr/min,離心力超過500Kg。

1.  差速離心(differential centrifugation)

在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心,用于分離不同大小的細胞和細胞器

在差速離心中細胞器沉降的順序依次為:核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、zui后為核蛋白體。

由于各種細胞器在大小和密度上相互重疊,而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中,一般重復2~3次效果會好一些。

差速離心只用于分離大小懸殊的細胞,更多用于分離細胞器。通過差速離心可將細胞器初步分離,常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。

2.  密度梯度離心(density gradient centrifugation)

用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度,將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部,通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫,蔗糖和多聚蔗糖。分離活細胞的介質(zhì)要求:1)能產(chǎn)生密度梯度,且密度高時,粘度不高;2)PH中性或易調(diào)為中性;3)濃度大時滲透壓不大;4)對細胞無毒。

(1)速度沉降

速度沉降(velocity sedimentation)主要用于分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。這種降方法所采用的介質(zhì)密度較低,介質(zhì)的zui大密度應小于被分離生物顆粒的zui小密度。

生物顆粒(細胞或細器)在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離。

(2)等密度沉降

等密度沉降(isopycnic sedimentation)適用于分離密度不等的顆粒。

細胞或細胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和是夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處,并停留在那里達到平衡,從而將不同密度的細胞或細胞器分離。

等密度沉降通常在較高密度的介質(zhì)中進行。介質(zhì)的zui高密度應大于被分離組分的zui大密度,而且介質(zhì)的梯度要求較高的陡度,不能太平緩。再者,這種方法所需要的力場通常比速率沉降法大10~100倍,故往往需要高速或超速離心,離心時間也較長。大的離心力、長的離心時間都對細胞不利。大細胞比小細胞更易受高離心力的損傷,而且停留在等密度介質(zhì)中的細胞比處在移動中的細胞受到更大的損傷。因此,這種方法適于分離細胞器,而不太適于分離和純化細胞。

二、流式細胞術

流式細胞術是對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術。在分析或分選過程中,包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴,形成包含單個細胞的液滴,在激光束的照射下,這些細胞發(fā)出散射光和熒光,經(jīng)探測器檢測,轉(zhuǎn)換為電信號,送入計算機處理,輸出統(tǒng)計結(jié)果,并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細胞亞群,分離純度可達99%。包被細胞的液流稱為鞘液,所用儀器稱為流式細胞計(flow cytometer)。

三、細胞電泳

在一定PH值下細胞表面帶有凈的正或負電荷,能在外加電場的作用下發(fā)生泳動,這種現(xiàn)象稱為細胞電泳(cell electrophoresis)。引起細胞電泳的電位值稱為ξ電位。各種細胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細胞荷電量有所不同,故在一定的電場中的泳動速度不同。在恒定的電場條件下,同種細胞的電泳速度相當穩(wěn)定,因而可通過測定電泳速度來推算出細胞的ξ電位。ξ電位常因細胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)而異,因此在診斷疾病上有一定價值。此外由于不同類型的細胞在電場中的泳動速度不同,細胞電泳尚可用來分離不同種類的細胞,例如可把淋巴樣細胞與造血細胞分開。

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