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士鋒生物蔗糖梯度分析

時間：2015-7-24閱讀：984

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蛋白在蔗糖梯度中的沉降率可以用于與已經(jīng)知道的S值與其在同梯度中蛋白相比來確定其S值。從而可用于計算蛋白的大約的分子量，也可用于鑒定兩個蛋白的相互作用，如果他們在相同梯度出峰。

一、材料和試劑

1. 蔗糖（SigmaCatalog No.S0389）

2. 明膠（SigmaCatalog No.G9136）

二、儀器

1.離心機(jī)（BeckmanFalcon，TLS-55）

2.梯度混合器（Sigma）

三、步驟

1. 用與蛋白樣品緩沖液相同的緩沖液制作10%和40%的蔗糖溶液。

2. 用的1%明膠包被管子，用1%的明膠溶液加滿管子，倒出凝膠溶液并用ddH₂O洗滌。

3. 制作10-40%蔗糖梯度

注意：梯度混合器有兩個室，儲存室和混合室，并用一個不互聯(lián)的膜隔開。用另一個膜來調(diào)控從混合器中流出。在混合室中的磁力攪拌器可以幫助保持一個不變的梯度所有的混合器都有一個平面用于放在磁力攪拌器上。

4. 將梯度混合器放在磁力攪拌器上面，使其水平。將一個小的攪拌子放入混合室中。

5. 使所有瓣膜關(guān)閉，用1/2想要的梯度量加入每個室中，用40%在混合室，10%蔗糖在儲存室。

6. 打開磁力攪拌器使得它輕輕的攪拌。

7. 將輸出管放到一個離心管中，使起剛剛碰到接近頂部的邊。

8. 同時打開兩個膜，40%蔗糖溶液開始進(jìn)入離心管，10%蔗糖開始與40%蔗糖混合。當(dāng)梯度接近離心管的頂部關(guān)閉兩個瓣膜。確定有足夠的地方放頂部的梯度樣品。

9. 把梯度的轉(zhuǎn)子放在冷室中2~48 hrs，確定管子平衡并且樣品在頂部，樣品只占很少的體積（如100 μl 對于2.2 ml 梯度溶液）。

10. 55 000 rpm 離心2.5小時。

11. 收集組分并且用Western blotting 檢測。醛縮酶（158 kD，7S）和甲狀腺球蛋白（690 kD，19S）（Bio-RadLaboratories）并用于marker被用于一起檢測。

四、配置方法

1. 10%蔗糖溶液：10 mg 蔗糖溶于100 ml ddH₂O

2. 40%蔗糖溶液：40 mg 蔗糖溶于100 ml ddH₂O

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