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士鋒微量DNA的純化

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1.對于微量DNA樣品溶液(如100ml以下),應預先將DNA溶液以TE或無菌水稀釋至一定體積。以減少第5步中的DNA損失。2.加入等體積的酚:氯仿:異戊醇[1](25:24:1)。3.劇烈振蕩管中內容物,將水相和有機相充分混勻,使之成為乳濁液。4.室溫下靜置以初步分層。再用離心機于室溫以10000rpm離心至少5分鐘以上,使無機相與有機相充分分開。5.用剪去尖頭的微量移液器槍頭[2]小心移出水相于一干凈離心管中(不要擾動界面上的蛋白質層),棄去有機相、兩相界面層及接近兩相界面層的水相。6. 重復步驟2-5直至兩相界面上看不到蛋白質層。7..加入等體積的氯仿并重復步驟2-5。8.加入1/10體積乙酸鈉(3.0mol/L,pH 5.2),再加入等體積的異丙醇,顛倒混勻。9.用離心機于室溫以10000rpm離心10分鐘使核酸沉淀[3]。傾掉上清液。10.加入1/2離心管體積的75%乙醇洗滌DNA沉淀[4]10分鐘。11.10000rpm離心2分鐘。使DNA沉淀緊貼管底。12.傾掉上清液,將離心管倒置于紙巾上使殘留液體揮發(fā)至干。13.用適當體積的TE(pH8.0)緩沖液溶解DNA沉淀,用緩沖液充分洗管壁。-20℃貯藏。 [1]任何含有或/和氯仿的試劑都應使用巴斯德吸管或玻璃滴管,切忌使用微量移液器,因和氯仿(尤其是后者)都對微量移液器具有強腐蝕性。[2]使用剪去尖頭的微量移液器槍頭以避免水流攪動界面。[3]純化良好的DNA沉淀于離心管底,無色透明,肉眼不可見。[4]只需浸泡靜置,不用將DNA沉淀重新懸浮。

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