摘要: 功能基因的篩選研究可為深入了解疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程,藥物作用機(jī)制,建立新的疾病診斷、預(yù)防、治療策略奠定基礎(chǔ),因而正在成為當(dāng)今藥物及藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的重要途徑。該領(lǐng)域的迅速發(fā)展很大程度上借助于技術(shù)方法的不斷提高和發(fā)展。本文對(duì)功能基因篩選研究策略及主要技術(shù)方法,如表達(dá)譜分析法、高通量細(xì)胞篩選技術(shù)、反義核酸技術(shù)、轉(zhuǎn)基因/ 基因敲除技術(shù)等的研究進(jìn)展及應(yīng)用進(jìn)行了綜述。 
近年來(lái),隨著人類基因組計(jì)劃的初步完成,后基因組時(shí)代蛋白質(zhì)組學(xué)、功能基因組學(xué)等研究的深入開(kāi)展給藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域帶來(lái)了革命?；蚪M龐大規(guī)模序列的可利用性、高通量基因表達(dá)檢測(cè)方法的發(fā)展及大規(guī)模數(shù)據(jù)分析能力的提高,為藥物發(fā)現(xiàn)展現(xiàn)了廣闊的前景。然而,新基因不等于新藥靶點(diǎn)或新藥物。目前,藥物發(fā)現(xiàn)的主要挑戰(zhàn)之一,就是要快速估測(cè)和了解新基因的生物學(xué)功能,確定該基因是否能夠成為藥物靶點(diǎn)或直接作為治療藥物(基因藥物或蛋白質(zhì)藥物) ,即進(jìn)行功能基因的篩選研究。功能基因的篩選研究正在成為當(dāng)今藥物及藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的重要途徑,同時(shí)也為深入了解疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程、藥物作用機(jī)制以及新的疾病診斷、預(yù)防、治療策略的建立奠定了基礎(chǔ)。這一領(lǐng)域的迅速發(fā)展很大程度上借助于眾多技術(shù)方法的發(fā)展和應(yīng)用,本文對(duì)其中一些主要方法及其研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。 
1、功能基因篩選的基本策略 
目前,國(guó)內(nèi)外進(jìn)行功能基因篩選研究的基本策略包括: (1) 通過(guò)表達(dá)譜差異分析、生物信息學(xué)分析和基因克隆等途徑獲得候選基因; (2) 對(duì)候選基因進(jìn)行功能評(píng)價(jià)(identification of function ,可在基因組、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)組和代謝產(chǎn)物等水平進(jìn)行); (3) 基因功能確證(validation of function); (4) 決定開(kāi)發(fā)戰(zhàn)略。 
1. 1 差異表達(dá)篩選功能基因 
獲得候選基因的研究路線之一是通過(guò)正常和疾病組織的表達(dá)譜差異分析(expression profiling of normal and diseased tissues) 獲得疾病的相關(guān)基因,進(jìn)一步進(jìn)行基因功能的篩選研究(圖1) 。該篩選策略與疾病過(guò)程密切相關(guān),較多地應(yīng)用于新藥及治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)[1～3 ] 。 
1. 2 生物信息學(xué)分析 
確定候選功能基因獲得候選基因的另一研究路線是通過(guò)生物信息學(xué)分析( bioinformatic analysis) 預(yù)測(cè)、選定基因序列、克隆獲得候選基因,進(jìn)一步進(jìn)行基因功能的篩選研究(圖2) [4 ] 。該研究策略篩選范圍廣,多用于新基因的功能探索研究。 
用于生物信息學(xué)分析的數(shù)據(jù)資料,主要來(lái)源于DNA 芯片技術(shù)和其他相關(guān)技術(shù)測(cè)定的基因表達(dá)信息[4 ] 。通過(guò)與已知基因或蛋白質(zhì)序列的分析、比較,可以確定候選研究基因序列長(zhǎng)度,提供該未知基因產(chǎn)物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白類型和細(xì)胞定位等預(yù)測(cè)信息[5 ] 。然而,由于人類基因組中約1/ 3 的基因序列與其他基因無(wú)同源性,因此這些基因的功能不易進(jìn)行直接預(yù)測(cè)。另一方面,蛋白質(zhì)的功能表現(xiàn)還與其所處的分子環(huán)境有關(guān),一種蛋白質(zhì)實(shí)際上與相鄰蛋白質(zhì)形成了功能網(wǎng)絡(luò)(functional networks) 。 
因此,生物信息學(xué)中的功能網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析,對(duì)于了解復(fù)雜信號(hào)通路及與其他基因產(chǎn)物的關(guān)系,可能會(huì)提供有價(jià)值的參考信息[6 ] 。 
1. 3 其他 
除上述研究策略外,其他途徑的功能基因研究也在進(jìn)行,如直接從正?；蚣膊〗M織中克隆單一未知基因,進(jìn)行功能研究。 
2 、表達(dá)譜分析法 
表達(dá)譜差異分析(differential expression profiling)主要包括基因表達(dá)譜(gene expression profiling) 和蛋白質(zhì)表達(dá)譜(protein expression profiling) [3 ,4 ,7 ] 。大規(guī)模表達(dá)譜分析已經(jīng)成為認(rèn)識(shí)疾病分子機(jī)制的有利方法,在癌癥研究等方面取得了一定的進(jìn)展[2～4 ] 。成功的表達(dá)譜分析基于實(shí)驗(yàn)及其過(guò)程分析的有機(jī)結(jié)合。實(shí)驗(yàn)過(guò)程從關(guān)注的疾病開(kāi)始,首先收集大量的疾病相關(guān)組織樣本,樣本數(shù)量可從10 多個(gè)到數(shù)百個(gè),但必須足以對(duì)每一組織類型及個(gè)體差異進(jìn)行比較分析,而且許多情況下不能僅簡(jiǎn)單地分為正常和疾病組織。例如,在對(duì)糖尿病的研究中,所收集的樣本來(lái)自健康人、胰島素耐受和糖尿病病人的不同試驗(yàn)階段,如胰島素治療前后。樣品還應(yīng)包括其他器官的取材,以便進(jìn)行基因表達(dá)的組織分布研究。為了便于對(duì)后來(lái)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析管理,需采集并儲(chǔ)存所有的組織樣本和臨床參數(shù)。接下來(lái)進(jìn)行組織樣本的處理,利用生物芯片(寡核苷酸芯片、cDNA 芯片或全基因組芯片) 進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)定,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 
通常,表達(dá)譜的分析結(jié)果需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。定量RT2PCR 是zui靈敏的確證方法,該方法還可以將確證實(shí)驗(yàn)的范圍擴(kuò)大到原測(cè)組織以外的更廣泛的組織和組織類型,揭示基因表達(dá)的組織分布情況。 
確證實(shí)驗(yàn)揭示了疾病相關(guān)基因。據(jù)此,可以進(jìn)行進(jìn)一步研究,探索這些基因的功能,開(kāi)發(fā)新的治療手段。例如,對(duì)于正常和疾病組織中表達(dá)有顯著性變化的基因,可以進(jìn)行新治療靶點(diǎn)的鑒定和確定研究,或利用實(shí)驗(yàn)和分析工具研究分析其功能;對(duì)于疾病組織中活性升高的酶,可以當(dāng)作前藥活化酶進(jìn)行鑒定研究。典型的表達(dá)譜能夠顯示疾病過(guò)程中有大量的已知基因表達(dá)的改變,而許多已知基因的代謝通路、表達(dá)產(chǎn)物酶學(xué)分類和蛋白質(zhì)功能業(yè)已發(fā)表,將兩者對(duì)照分析,可以鑒定出酶活性,選擇其中可能成為前藥活化酶的部分進(jìn)行進(jìn)一步研究;對(duì)于疾病特異的蛋白質(zhì),可以進(jìn)行抗原表型分析,決定疫苗的開(kāi)發(fā)策略[1 ] 。 
尋找差異表達(dá)基因的方法除芯片技術(shù)外,一些新的檢測(cè)方法如差異顯示PCR ( differential display PCR, DD－PCR) 、消減雜交( suppression subreactive hy bridization , SSH) 等也相繼得到結(jié)合應(yīng)用[8 ,9 ] 。