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中級(jí)會(huì)員 | 第14年

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標(biāo)準(zhǔn)品
培養(yǎng)基
培養(yǎng)基原料 霍亂弧菌診斷血清 大腸艾希氏菌診斷血清 志賀氏菌屬診斷血清 沙門氏菌屬診斷血清 標(biāo)準(zhǔn)血清,診斷血清 抗生素藥敏紙片 微生物配套試劑 微生物生化管 管裝培養(yǎng)基 即用型液體培養(yǎng)基 一次性培養(yǎng)基平板 顯色培養(yǎng)基 臨床培養(yǎng)基 菌種保存培養(yǎng)基 四環(huán)素檢定、厭氧亞硫酸鹽還原桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基 維生素檢測(cè)培養(yǎng)基 一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生檢測(cè)培養(yǎng)基 罐頭食品商業(yè)無(wú)菌檢測(cè)培養(yǎng)基 飲用水及水源檢測(cè)培養(yǎng)基 藥品、生物制品檢測(cè)培養(yǎng)基 化妝品檢測(cè)培養(yǎng)基 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基 啤酒檢驗(yàn)培養(yǎng)基 軍團(tuán)菌檢測(cè)培養(yǎng)基 支原體檢測(cè)培養(yǎng)基 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 彎曲桿菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、厭氧菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 阪崎腸桿菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 溶血性鏈球菌檢測(cè)培養(yǎng)基 李斯特氏菌檢測(cè)培養(yǎng)基 弧菌檢測(cè)培養(yǎng)基 乳酸菌、雙歧桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基 酵母、霉菌檢測(cè)培養(yǎng)基 檢測(cè)培養(yǎng)基 沙門氏菌、志賀氏菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌及腸桿菌科檢測(cè)培養(yǎng)基 細(xì)菌總數(shù)檢測(cè),增菌培養(yǎng)基
抗體
生物試劑
細(xì)胞
菌株
血清
細(xì)胞分離試劑
試劑盒

如何進(jìn)行RNA的制備

時(shí)間:2015-12-31閱讀:864
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來(lái)源于任何細(xì)胞的RNA都可以通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶的作用拷貝成雙鏈DNA并克隆化,獲得相應(yīng)的于特定細(xì)胞來(lái)源的cdna文庫(kù)。因此,RNA制備的意義有兩個(gè)方面
* 獲得特定細(xì)胞來(lái)源的cDNA文庫(kù),克隆目的基因
* 分析基因的表達(dá),闡明基因調(diào)控的特性,了解從基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA的結(jié)構(gòu),數(shù)量,水平及合成的速率
抑制rna酶活性的方法
1. 滅菌法:將RNA提取過(guò)程中的使用的器具進(jìn)行高溫滅菌處理(180 ºC,8h),溶液等在高壓下蒸汽滅菌15min(1.034 X 105 Pa)
2. 焦碳酸二乙酯(DEPC)抑制法:DEPC是RNA酶的強(qiáng)烈抑制劑,塑料或玻璃器皿在含0.1%的DEPC溶液中浸泡2h,然后以滅菌水淋洗數(shù)次,在100 ºC下干烤15min。
3. RNA酶抑制劑法:利用RNA酶蛋白質(zhì)抑制劑與RNA酶緊密結(jié)合防止其發(fā)揮酶活作用;利用氧釩核糖核苷復(fù)合物與RNA酶結(jié)合;利用硅藻土吸附RNA酶。
一、細(xì)菌RNA的制備
1.菌體培養(yǎng) 同上
2. 離心收集菌體菌體
經(jīng)離心(5000g,5min)后,懸浮于終止緩沖液中(200mM Tris-HCl,pH8.0; 20 mM EDTA; 20 mM Na2N3; 20 mM 金精三羧酸(ATA))
3. 菌體裂解 
加入STET緩沖液(8% 蔗糖; 5% Triton X-100; 50mM EDTA; 50mM Tris-HCl pH 7.0)懸浮加入0.2 M 的VRC (0.2M和10 mM的氧釩核苷復(fù)合物)
4. RNA提取
加入0.5 V的振蕩1 min,0.5 V氯仿振蕩1 min,10 000 g, 10 min,水相加入1/10 V的NaAc, 2 V的無(wú)水乙醇10000 g, 10 min沉淀溶于0,2 M 的VRC,以酚-氯仿抽提兩次
5. RNA純化
重溶沉淀于DEPC(焦碳酸二乙酯)處理的水中,加入CsCl溶液,于室溫離心(200000 g,1 h)回收RNA沉淀,溶于DEPC處理的水中,加入1/10 V的3 M的NaAc, 2 V的乙醇,離心后
6.RNA的溶解
將RNA沉淀溶于水中
二、植物組織細(xì)胞RNA的制備
1.細(xì)胞處理: 將植物組織置于液氮中凍結(jié),研成粉末,加入勻漿緩沖液,高速勻漿,后高速離心(20000g,10 min) 
2.RNA提取:上清液中加入皂土(4%),等體積的酚,低溫振蕩5min,200000 g, 10 min
3.重復(fù)該步驟一次
4.RNA沉淀: 于上清液中加入KAc至終濃度為0.2 M,加兩倍體積 的無(wú)水乙醇,于0oC 30 min,30000g,20 min
5.RNA的溶解:沉淀溶于水中或TE緩沖液
三、哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)RNA的制備
1.細(xì)胞培養(yǎng): 人工組織培養(yǎng)
2.細(xì)胞裂解:以含磷酸緩沖液(PBS)的生理鹽水洗細(xì)胞懸浮于預(yù)冷的溶胞緩沖液中,加入24%的蔗糖,1%的NP-40溶胞緩沖液
3.去蛋白: 加入Protease K,于37 ºC溫育30 min,酚抽提
4.去DNA:乙醇沉淀,懸浮于DNA消化液(DNase I, 0.2% SDS)
5. 沉淀RNA: 加入終濃度為0.3 M的NaAc, 2V 無(wú)水乙醇于-20 ºC 2 h, 離心收集RNA.
四、mRNA的分離提純—寡聚(dT)-纖維素柱法
上柱緩沖液:
20 mmol/L Tris-HCl (pH7.6)
0.5 mol/L NaCl
1 mmol/L EDTA (pH8.0)
0.1% 十二烷基肌氨酸鈉
洗脫緩沖液:
10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)
1 mmol/L EDTA (pH8.0)
0.05% SDS
寡聚(dT)-纖維素柱法提純mRNA的過(guò)程

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