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中級(jí)會(huì)員 | 第14年

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當(dāng)前位置:首頁   >>   資料下載   >>   總RNA分離純化標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)

標(biāo)準(zhǔn)品
培養(yǎng)基
培養(yǎng)基原料 霍亂弧菌診斷血清 大腸艾希氏菌診斷血清 志賀氏菌屬診斷血清 沙門氏菌屬診斷血清 標(biāo)準(zhǔn)血清,診斷血清 抗生素藥敏紙片 微生物配套試劑 微生物生化管 管裝培養(yǎng)基 即用型液體培養(yǎng)基 一次性培養(yǎng)基平板 顯色培養(yǎng)基 臨床培養(yǎng)基 菌種保存培養(yǎng)基 四環(huán)素檢定、厭氧亞硫酸鹽還原桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基 維生素檢測(cè)培養(yǎng)基 一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生檢測(cè)培養(yǎng)基 罐頭食品商業(yè)無菌檢測(cè)培養(yǎng)基 飲用水及水源檢測(cè)培養(yǎng)基 藥品、生物制品檢測(cè)培養(yǎng)基 化妝品檢測(cè)培養(yǎng)基 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基 啤酒檢驗(yàn)培養(yǎng)基 軍團(tuán)菌檢測(cè)培養(yǎng)基 支原體檢測(cè)培養(yǎng)基 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 彎曲桿菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、厭氧菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 阪崎腸桿菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 溶血性鏈球菌檢測(cè)培養(yǎng)基 李斯特氏菌檢測(cè)培養(yǎng)基 弧菌檢測(cè)培養(yǎng)基 乳酸菌、雙歧桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基 酵母、霉菌檢測(cè)培養(yǎng)基 檢測(cè)培養(yǎng)基 沙門氏菌、志賀氏菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌及腸桿菌科檢測(cè)培養(yǎng)基 細(xì)菌總數(shù)檢測(cè),增菌培養(yǎng)基
抗體
生物試劑
細(xì)胞
菌株
血清
細(xì)胞分離試劑
試劑盒

總RNA分離純化標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)

時(shí)間:2016-1-19閱讀:737
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主要儀器
研缽,恒溫水浴,旋渦振蕩器,冷凍臺(tái)式高速離心機(jī),
超低溫冰箱,紫外檢測(cè)儀,電泳儀,電泳槽。

試劑
1.Trizol試劑(購(gòu)自invitrogen公司)
2.焦碳酸二乙酯(DEPC)
3.氯仿(新開封)
4.異丙醇(新開封)
5.無RNAse滅菌水:用將高溫烘烤的玻璃瓶(250℃ 3小時(shí))裝蒸餾水,然后加入0.1%的DEPC(體積/體積),處理過夜后高壓滅菌。
6.75%乙醇:用DEPC處理后的水配制75%乙醇,(用高溫滅菌器皿配制),然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中,存放于4℃冰箱。 

相關(guān)器皿的預(yù)處理
1.塑料制品的處理
盡可能使用無菌,一次性塑料制品,已經(jīng)標(biāo)明RNase-Free的塑料制品,如果沒有開封使用過通常沒有必要再次處理。對(duì)于國(guó)產(chǎn)塑料制品,原則上都必須處理方可使用。處理步驟如下:
1)在玻璃燒杯中注入去離子水,加入DEPC使其終濃度為0.1%。注意:DEPC為劇毒物質(zhì),活性很強(qiáng),應(yīng)在通風(fēng)櫥中小心使用。
2)將需要處理的塑料制品放入一個(gè)可以高溫滅菌的容器中,注入DEPC水溶液,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3)在通分櫥中室溫處理過夜。
4)將DEPC水溶液小心倒入廢液瓶中,用鋁箔封住含有已用DEPC水處理過的塑料制品的容器,高溫高壓蒸汽滅菌至少30 min。
5)在烘箱中用合適的溫度烘烤至干燥。置于干凈處備用。
2.玻璃和金屬制品
先用去離子水將器皿清洗干凈,晾干,用鋁箔包好,然后至烘箱中250℃烘烤3 小時(shí)以上。

操作步驟
*部分 勻漿
A 從組織中提取總RNA、
1)液氮研磨:組織塊直接放入研缽中,加入少量液氮,迅速研磨,待組織變軟,再加少量液氮,再研磨,如此三次,按照每50~100mg組織加入1ml Trizol,轉(zhuǎn)入離心管進(jìn)行下步操作。
2)勻漿:用電動(dòng)勻漿器充分勻漿1~2min。注意,組織樣品體積不能超過Trizol體積的10%,否則勻漿效果會(huì)不好。
B 從培養(yǎng)細(xì)胞中提取總RNA
1)粘壁培養(yǎng)細(xì)胞:不需蛋白酶消化,先將培養(yǎng)基去除,然后直接將Trizol加入到培養(yǎng)瓶中消化、裂解細(xì)胞,Trizol體積按10cm2/ml的比例加入。
2)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞:直接離心收集細(xì)胞后用Trizol重懸、裂解,每1ml Trizol可裂解5×106個(gè)動(dòng)物、植物或酵母細(xì)胞,或1×107個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。注意,在加入Trizol之前不能用其他緩沖液洗滌細(xì)胞,那樣會(huì)增加mRNA降解的可能性。另外,在裂解酵母或細(xì)菌細(xì)胞時(shí)可以借助勻漿器。
第二部分 相分離
1.勻漿組織加入Trizol后,室溫放置5min,使其充分裂解。注意:此時(shí)可以放入-70℃保存。
2.室溫,12000 r/min,離心5 min。取上清于一新管。
3.按照1ml Trizol加入200µl氯仿,用手振蕩混勻后室溫放置2~3 min。注意:禁用漩渦振蕩器,以免基因組DNA斷裂。
4.4℃,12000 r/min,離心15 min。小心吸取上層水相于一新管。注意:千萬不要吸取中間界面;若同時(shí)提取DNA和蛋白質(zhì),則保留下層酚相存于4℃冰箱中,如只提取RNA,則棄下層酚相。
第三部分 RNA沉淀
5.按照1ml Trizol加入異丙醇0.5 ml,混勻,室溫放置5~10 min。
6.4℃,12000 r/min,離心15min。棄上清,RNA沉淀管底。注意:RNA沉淀在離心之前是不可見的,常常在離心管的邊緣或者底部形成凝膠狀小球。
第四部分 RNA洗滌

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