時(shí)熒光定量PCR以其、快速、方便，越來(lái)越多的應(yīng)用在科研、臨床及檢驗(yàn)檢疫的各個(gè)領(lǐng)域。但是定量PCR是對(duì)性要求很高的實(shí)驗(yàn)，不僅要求在實(shí)驗(yàn)前有比較完整的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，而且實(shí)驗(yàn)的條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響也非常大。這些都是很多老師與學(xué)生非常關(guān)心的問題，下面分別從這兩個(gè)方面來(lái)對(duì)定量PCR實(shí)驗(yàn)做一些闡述。 
定量pcr實(shí)驗(yàn)步驟（以mRNA為例）： 
1.設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案：例如對(duì)樣品、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的一個(gè)實(shí)驗(yàn)流程設(shè)計(jì) 
2.引物和探針的設(shè)計(jì)和合成 
3.抽提RNA，測(cè)定提取的RNA的濃度 
4.反轉(zhuǎn)錄PCR 
5.定量PCR 
6.數(shù)據(jù)分析 
在進(jìn)行定量PCR實(shí)驗(yàn)的過程中，PCR的擴(kuò)增效率是一個(gè)非常重要的影響因素，因?yàn)槎縋CR原理的理論方程是基于擴(kuò)增效率zui大值1，因此高的擴(kuò)增效率能保證定量PCR實(shí)驗(yàn)的性及重復(fù)性，影響PCR擴(kuò)增效率主要有以下幾個(gè)方面：1，擴(kuò)增子的長(zhǎng)度；2，擴(kuò)增子的GC含量；3，擴(kuò)增子、引物和探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)；4，PCR反應(yīng)各組分的濃度；5，RNA或者cDNA的純度。 
進(jìn)行定量PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須設(shè)計(jì)好引物和探針，除了能獲得高的擴(kuò)增效率外，對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性、消除基因組DNA的擴(kuò)增及提高擴(kuò)增的靈敏度都有很大的影響。下圖就是使用不同的引物和探針對(duì)18SRNA進(jìn)行定量PCR的熒光曲線圖（反應(yīng)條件和模板都相同）。

探針設(shè)計(jì)的基本原則：
1. 保守：探針要的保守，有時(shí)分型就僅僅依靠探針來(lái)決定。理論上有一個(gè)堿基不配對(duì)，就可能檢測(cè)不出來(lái)。