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引物設計基本原則

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引物設計原則:

1。長度 一般為15-30bp,常用的是18-27bp,但不能大于38,因為過長會導致其延伸溫度大于74℃,即taq酶的zui適溫度

2。堿基分布的均衡性 同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應超過5個

GC含量一般40-60%

GC含量太低導致引物Tm值較低,使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性

GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴增。

3。引物Tm值 一般要求:55℃-65℃。

計算:

對于低于20個堿基的引物,Tm值可根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算

對于較長引物,Tm值則需要考慮熱動力學參數(shù),從“zui近鄰位”的計算方式得到,這也是現(xiàn)有的引物設計軟件zui常用的計算方式。

Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15

4。引物二級結構 引物二聚體

盡可能避免兩個引物分子之間3’端有有較多堿基互補發(fā)夾結構尤其是要避免引物3’端形成發(fā)夾結構,否則將嚴重影響dna聚合酶的延伸。

5。引物3’端 引物的延伸從3’端開始,因此3’端的幾個堿基與模板DNA均需嚴格配對,不能進行任何修飾,否則不能進行有效的延伸,甚至導致PCR擴增*失敗。考慮到密碼子的簡并性,引物3’端zui后一個堿基不與密碼子第三個堿基配對。

6。引物5’端 引物5’端可以有與模板DNA不配對堿基,在5’端引入一段非模板依賴性序列。

5’端加上限制性核酸內切酶位點序列(酶切位點5’端加上適當數(shù)量的保護堿基)。

5’端的某一位點修改某個堿基,人為地在產物中引入該位點的點突變以作研究。

5’端標記放射性元素或非放射性物質(如、)。

6。引物的內部穩(wěn)定性 過去認為,引物3’端應牢牢結合在模板上才能有效地進行延伸,故3’端為G或C。

現(xiàn)在的觀點認為,引物的5’端應是相對穩(wěn)定結構,而3’端在堿基配對的情況下為低穩(wěn)定性結構,即3’端盡可能選用A或T,少用G或C。僅僅3’端幾個堿基與非特異位點上的堿基形成的低穩(wěn)定性結構是難以有效引發(fā)引物延伸的,如果3’端為富含G、C的結構,只需3’端幾個堿基與模板互補結合,就可能引發(fā)延伸,造成假引發(fā)。

7。引物的保守性與特異性 保守性:通用引物——檢測同一類病原微生物盡可能多的型別

特異性:避免非特異性擴增

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