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中級會(huì)員 | 第14年

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標(biāo)準(zhǔn)品
培養(yǎng)基
培養(yǎng)基原料 霍亂弧菌診斷血清 大腸艾希氏菌診斷血清 志賀氏菌屬診斷血清 沙門氏菌屬診斷血清 標(biāo)準(zhǔn)血清,診斷血清 抗生素藥敏紙片 微生物配套試劑 微生物生化管 管裝培養(yǎng)基 即用型液體培養(yǎng)基 一次性培養(yǎng)基平板 顯色培養(yǎng)基 臨床培養(yǎng)基 菌種保存培養(yǎng)基 四環(huán)素檢定、厭氧亞硫酸鹽還原桿菌檢測培養(yǎng)基 維生素檢測培養(yǎng)基 一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生檢測培養(yǎng)基 罐頭食品商業(yè)無菌檢測培養(yǎng)基 飲用水及水源檢測培養(yǎng)基 藥品、生物制品檢測培養(yǎng)基 化妝品檢測培養(yǎng)基 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基 啤酒檢驗(yàn)培養(yǎng)基 軍團(tuán)菌檢測培養(yǎng)基 支原體檢測培養(yǎng)基 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 彎曲桿菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、厭氧菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 阪崎腸桿菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 溶血性鏈球菌檢測培養(yǎng)基 李斯特氏菌檢測培養(yǎng)基 弧菌檢測培養(yǎng)基 乳酸菌、雙歧桿菌檢測培養(yǎng)基 酵母、霉菌檢測培養(yǎng)基 檢測培養(yǎng)基 沙門氏菌、志賀氏菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌及腸桿菌科檢測培養(yǎng)基 細(xì)菌總數(shù)檢測,增菌培養(yǎng)基
抗體
生物試劑
細(xì)胞
菌株
血清
細(xì)胞分離試劑
試劑盒

質(zhì)粒DNA提取與瓊脂糖凝膠電泳

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  堿變性法提取質(zhì)粒dna
  
  質(zhì)粒(Plasmid)是細(xì)菌染色體外能自身獨(dú)立復(fù)制的雙股環(huán)狀DNA。帶有遺傳信息,可賦予細(xì)菌某些新的表型。將質(zhì)粒指紋圖譜分析方法、質(zhì)粒DNA探針技術(shù)及檢測質(zhì)粒的PCR技術(shù)用于臨床感染性疾病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查已成為現(xiàn)實(shí)。質(zhì)粒作為載體在基因工程中起著重要的作用。
  
  分離和純化質(zhì)粒DNA的方法很多,但這些方法基本包括三個(gè)步驟:即細(xì)菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增,細(xì)菌菌體的裂解;質(zhì)粒dna的提取與純化。
  
  本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)用堿變性方法提取質(zhì)粒DNA。
  
  【原理】
  
  細(xì)菌培養(yǎng)物加入SDS和NaOH堿性溶液處理后,菌體裂解,可使細(xì)菌的質(zhì)粒DNA、染色體DNA和RNA一起從細(xì)胞內(nèi)釋放出來,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,因各種核酸分子的遷移率不同將上述核酸分成不同的帶。用溴化乙錠(EB)染色后,在紫外線燈下可看到各種核酸帶發(fā)出的熒光。根據(jù)熒光的位置,可區(qū)分不同的核酸帶。
  
  【材料】
  
  1.菌株E.coliJM109(pUC19),E.coliRRI(pBR322)
  
  2.試劑溶液Ⅰ(50mM葡萄糖,25mMTris.HclPH8.0,10mMEDTA)
  
  溶液II(0.2NNaOH,1%SDS)用前新配制
  
  溶液III(5mMKAc溶液PH4.8)
  
  TE緩沖液(10mMTris.Hcl,1mMEDTAPH8.0)
  
  LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g,,酵母粉5g,Nacl10g.加蒸餾水溶解,用NaOH調(diào)PH至7.5,加水至1000ml,15磅高壓滅菌15分鐘)。
  
  【方法】
  
  1.接種細(xì)菌于5mlLB液體培養(yǎng)基中,370C培養(yǎng)過夜。
  
  2.3000rpm/min,離心15min,棄上清。加入100ul溶液1懸起細(xì)菌沉淀。
  
  3.加入200ul前新配制的溶液II,顛倒EP管5次混合均勻,置冰浴2min。
  
  4.加入150ul溶液III溫和地混勻,12000rpm/min,離心5min。
  
  5.吸取上清清亮裂解液放入另一新EP管中,加等體積酚-氯仿-異戊醇抽提2次,12000rpm/min,離心2min。(若不做酶切,此步可省略)吸取上清放入另一新EP管中,加入二倍體積的冷乙醇,12000rpm/min,離心10min。
  
  6.棄乙醇,干燥后用30ulTE緩沖液洗下核酸,待電泳檢測。
  
  (二)瓊脂糖凝膠電泳
  
  瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)(Agarosegelelectroghoresis)是分離、鑒定和提純DNA片斷的有效方法。凝膠分辨率決定于使用材料的濃度,并由此決定凝膠的孔徑。瓊脂糖凝膠可分辯0.1~6.0kb的雙鏈DNA片段。瓊脂糖凝膠電泳是一個(gè)電場作用。它首先利用瓊脂糖的分子篩效應(yīng),此外,在弱堿性條件下,DNA分子帶負(fù)電荷,從負(fù)極向正極移動(dòng)。根據(jù)DNA分子大小、結(jié)構(gòu)及所帶電荷的不同,它們以不同的速率通過介質(zhì)運(yùn)動(dòng)而相互分離。借助溴化乙錠(EB)能與雙鏈DNA結(jié)合的作用,利用EB染色,并通過紫外線激發(fā)即可觀察被分離DNA片段的位置。
  
  【材料】
  
  1.瓊脂糖、10×TAE電泳緩沖液(40mMTris,20mMNaAc,1mMEDTAPH8.0)
  
  2.載體緩沖液(0.25%溴酚藍(lán),30%甘油)、溴化乙錠水溶液(10mg/ml)
  
  3.凝膠槽、電泳儀
  
  【方法】
  
  1.取瓊脂糖0.9g,加入100ml1xTAE電泳緩沖液于250ml燒瓶中,1000C加熱溶解。
  
  2.平衡凝膠槽,放好兩側(cè)擋板,調(diào)節(jié)好梳子與底板的距離(一般高出底板0.5~1mm)。
  
  3.鋪板:在溶解好的凝膠中加入終濃度為0.5ug/ml的溴化乙錠水溶液,輕輕混勻,待冷至500C左右倒入凝膠槽,膠厚一般為5~8mm。
  
  4.待膠*凝固后,去掉兩側(cè)擋板,將凝膠放入盛有電泳液的槽中(加樣孔朝向負(fù),DNA由負(fù)極向正極移動(dòng)),使液面高出凝膠2~3mm,小心拔出梳子。
  
  5.DNA樣品與載體緩沖液5:1混合并加入凹孔中(樣品不可溢出)。
  
  6.打開電源,調(diào)節(jié)所需電壓,電壓與凝膠的長度有關(guān),一般使用電壓不超過5v/cm。
  
  7.據(jù)指示染料移動(dòng)的位置,確定電泳是否終止(溴酚藍(lán)的涌動(dòng)距離在5sRNA和0.3kbDNA帶之間)。
  
  8.電泳完畢關(guān)閉電源。將凝膠放紫外燈下觀察并拍照。

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