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標(biāo)準(zhǔn)品
培養(yǎng)基
培養(yǎng)基原料 霍亂弧菌診斷血清 大腸艾希氏菌診斷血清 志賀氏菌屬診斷血清 沙門氏菌屬診斷血清 標(biāo)準(zhǔn)血清,診斷血清 抗生素藥敏紙片 微生物配套試劑 微生物生化管 管裝培養(yǎng)基 即用型液體培養(yǎng)基 一次性培養(yǎng)基平板 顯色培養(yǎng)基 臨床培養(yǎng)基 菌種保存培養(yǎng)基 四環(huán)素檢定、厭氧亞硫酸鹽還原桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基 維生素檢測(cè)培養(yǎng)基 一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生檢測(cè)培養(yǎng)基 罐頭食品商業(yè)無(wú)菌檢測(cè)培養(yǎng)基 飲用水及水源檢測(cè)培養(yǎng)基 藥品、生物制品檢測(cè)培養(yǎng)基 化妝品檢測(cè)培養(yǎng)基 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基 啤酒檢驗(yàn)培養(yǎng)基 軍團(tuán)菌檢測(cè)培養(yǎng)基 支原體檢測(cè)培養(yǎng)基 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 彎曲桿菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、厭氧菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 阪崎腸桿菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 溶血性鏈球菌檢測(cè)培養(yǎng)基 李斯特氏菌檢測(cè)培養(yǎng)基 弧菌檢測(cè)培養(yǎng)基 乳酸菌、雙歧桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基 酵母、霉菌檢測(cè)培養(yǎng)基 檢測(cè)培養(yǎng)基 沙門氏菌、志賀氏菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌及腸桿菌科檢測(cè)培養(yǎng)基 細(xì)菌總數(shù)檢測(cè),增菌培養(yǎng)基
抗體
生物試劑
細(xì)胞
菌株
血清
細(xì)胞分離試劑
試劑盒

雙酶切連接轉(zhuǎn)化反應(yīng)之全攻略

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1、回收PCR產(chǎn)物:在進(jìn)行pcr擴(kuò)增時(shí)候,給引物兩端設(shè)計(jì)好酶切位點(diǎn),一般說來(lái),限制酶的 選擇非常重要,盡量選擇粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶,如BamHI,HindIII,提前看好各公司的雙切酶所用公用的BUFFER,以及各酶在公用BUFFER里的效率。選好酶切位點(diǎn)后,在各個(gè)酶的兩邊加上保護(hù)堿基,其原則可參照:http://img.dxy.cn/upload/2006/08/13/31219184.pdf。

雙酶切時(shí)間及其體系:需要強(qiáng)調(diào)的是很多人建議酶切過夜,其實(shí)*沒有必要,我一般酶切3個(gè)小時(shí),其實(shí)1個(gè)小時(shí)已經(jīng)足夠。應(yīng)用大體系,如100微升。

純化問題:純化PCR產(chǎn)物割膠還是柱式,我柱式,因?yàn)楦钅z手法不準(zhǔn),很容易割下大塊的膠,影響純化效率?,F(xiàn)在的柱式純化號(hào)稱可以祛除引物,既然如此,酶切掉的幾個(gè)堿基肯定也會(huì)被純化掉了。所以,PCR產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物的純化均可應(yīng)用柱式純化。我用的是TaKaRa的純化柱試劑盒

酶量的問題:以TAKARA的為例,其對(duì)1單位酶的定義如下:在50 μl 反應(yīng)液中,30℃溫度下反應(yīng)1小時(shí),將1 μg 的λDNA*分解的酶量定義為1個(gè)活性單位(U)。 而該酶濃度約為15單位/微升,在除外酶降解的 因素外,該酶可分解15μg的DNA,而一般從1-4ml菌液提出的 DNA約為3μg,而PCR純化后的產(chǎn)物(50體系)約為3μg,所以即便全部加進(jìn)去,只要純化的 質(zhì)量好,酶切*切得動(dòng)。

2、酶切、回收后的PCR產(chǎn)物與載體的連接

摩爾比的計(jì)算,很多人憑經(jīng)驗(yàn)也可以。但對(duì)于初學(xué)者從頭認(rèn)真計(jì)算則 非常有必要。回收的載體片段:回收的PCR產(chǎn)物片段=1:10 ,一般取前者0.03pmol,后者取0.3pmol。

pmol為單位的DNA轉(zhuǎn)換為為µg單位的DNA:(X pmoles×長(zhǎng)度bp×650)/ 1,000,000 (注:長(zhǎng)度bp×650是該雙鏈DNA的分子量)所得數(shù)值即為µg,也可以直接用這個(gè)公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如載體是5380bp,則0.03pmol為

0.03×5.38×0.66=0.106524µg。

測(cè)DNA濃度可以在機(jī)子上測(cè),注意OD值,一般約1.8-2.0.另外,如果嫌麻煩,也可用MARKER進(jìn)行估測(cè),如MARKER2000,5微升的 MARKER每個(gè)條帶約50ng。

連接反應(yīng):TAKARA的 連接酶上的 說明寫的過夜,而其對(duì)連接酶單位的定義為:在20 μl的連接反應(yīng)體系中,6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反應(yīng)30分鐘時(shí),有90%以上的DNA片段被連接所需要的酶量定義為1個(gè)活性單位(U)。而它的濃度為350 U/μl ,所以*夠用。連接酶容易失活,注意低溫操作,在冰上。時(shí)間3個(gè)小時(shí)足已。

3、轉(zhuǎn)化:

a、全量(10 μl)加入至100 μl JM109感受態(tài)細(xì)胞中,冰中放置30分鐘。

b、42℃加熱45秒鐘后,再在冰中放置1分鐘。

c、加入890 μl AMP陰性培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)60分鐘。

取100μl鋪板。也可離心后余100μl

幾個(gè)非常重要的問題

1 做轉(zhuǎn)化的時(shí)候,進(jìn)行酶連接反應(yīng)時(shí),注意保持低溫狀態(tài),因?yàn)長(zhǎng)IGASE酶很容易降解.為保險(xiǎn)起見,一般連接3小時(shí),16度.

2 對(duì)含有AMP-RESISTENCE的質(zhì)粒鋪板時(shí),注意加AMP時(shí)的溫度,溫度過高,會(huì)使克隆株無(wú)法篩選出來(lái).我的方法是培基高溫消毒后放在烤箱里,烤箱一般溫度為55-60度,然后做的時(shí)候拿出來(lái),這樣好掌握溫度。鋪板前后注意用吹風(fēng)機(jī)吹干

3對(duì)照的設(shè)立:

為驗(yàn)證雙酶切是否成功,可做如下對(duì)照:

A 酶切反應(yīng)時(shí)加各單酶分別切,兩管,用同一種BUFFER,跑膠,看單切的兩管是否成線性.如兩管均成線性可初步判斷雙酶切成功.

做轉(zhuǎn)化時(shí),也要進(jìn)行對(duì)照.

設(shè)4個(gè):

A.即拿雙酶切的質(zhì)粒產(chǎn)物也進(jìn)行連接反應(yīng),這個(gè)對(duì)照可進(jìn)一步看雙酶切是否成功,如果長(zhǎng)出克隆,說明很有可能只進(jìn)行了單酶切,如沒長(zhǎng)出克隆,則證明雙酶切成功,當(dāng)然要保證感受態(tài),培基,連接酶都'正常'的情況下.

B.酶切過的未進(jìn)行連接反應(yīng)的雙酶切產(chǎn)物,進(jìn)行轉(zhuǎn)化,這一步可以證明是否有殘留的未被任何酶切的原始質(zhì)粒

C.設(shè)原始質(zhì)粒為對(duì)照,意為檢測(cè)整個(gè)操作過程中是否有誤.

D.AMP陰性板上用同一批感受態(tài)細(xì)胞鋪板20微升足夠,檢測(cè)感受態(tài)狀況.

4.所有的試劑切記低溫保存.一步一個(gè)腳印.不要偷懶,圖省事zui后卻更費(fèi)事.注意設(shè)立對(duì)照。

經(jīng)PCR鑒定,克隆90%-的陽(yáng)性率,所以在后面的 挑克隆中,我只挑選4個(gè)就足夠了。然后雙酶切鑒定,測(cè)序。。。。。。

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