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培養(yǎng)基
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DNA的限制性核酸內(nèi)切酶酶切實驗和連接實驗

時間:2016-7-6閱讀:771
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酶切實驗

本實驗學(xué)習(xí)用限制性核酸內(nèi)切酶(Restriction endonuclease)EcoRI 切割λDNA及質(zhì)粒pBR322DNA,瓊脂糖凝膠電泳后觀察酶切結(jié)果。

【原理】

λDNA 是大腸桿菌的一種溫和噬菌體DNA,雙股線狀,分子大小為48.5 kb。 EcoRI酶可識別DNA中 G↓AATTC核苷酸序列,并在箭頭處將其切開。λDNA含有5個EcoRI酶識別位點,可將λDNA切成6個大小不同的片斷。pBR322 DNA為人工構(gòu)建的質(zhì)粒dna, 分子大小為4.3 kb,含有1個EcoR I酶切點,切割后由環(huán)狀DNA變?yōu)榫€形DNA。

【材料】

1.λDNA(0.1ug/ul),pBR322 DNA(0.25 ug/ul)

2.限制性內(nèi)切酶EcoRI

3.EcoRI 酶切緩沖液(Buffer solution 10×)

4.去離子水

5.電泳及染色用材料

【方法】

1.取潔凈EP管2只,按表10-1加入各成分。

2.混勻,放370C水浴1-2h。65℃水浴10min,再放4℃冰箱8min終止反應(yīng)。部分酶切DNA片段用于DNA連接實驗,另一部分放4℃冰箱,待瓊脂糖凝膠電泳檢測。

(二)DNA連接實驗

T4 DNA 連接酶是一單鏈多肽,分子量為68,000道爾頓,它能催化雙鏈DNA上相鄰的3ˊ羥基和5ˊ磷酸末斷形成磷酸二脂鍵。λDNA用EcoRI酶切割后形成的6個片斷均具有粘性末端(Cohesive ends),在T4 DNA 連接酶作用下,可連接成原來的線狀DNA

【材料】

1.λDNAEcoRI酶切片段

2.T4 DNA連接酶

3.T4 DNA連接酶緩沖液(10×)

4.去離子水

【方法】

1.取潔凈EP管1只,分別加入:

①去離子水 7ul,

②T4 DNA連接酶緩沖液(10×) 2 ul,

③λDNA酶切片段(已65℃10分鐘滅活)10ul

④T4 DNA連接酶1ul

2.混勻后,放13℃水浴過夜,待電泳檢測。

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