【實驗?zāi)康摹?nbsp;
掌握微絲的染色方法，了解光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下微絲的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)。 
【實驗用品】 
一、材料和標(biāo)本 蓋片培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞三片。 
二、器材和儀器 光學(xué)顯微鏡一臺、鑷子一把、小平皿六個、載片三個、吸水紙、37℃恒溫箱。 
三、試劑 PBS(pH7.2)、2％Triton X—100液、M—緩沖液、3％戊二醛固定液、0.2％考馬斯亮蘭染液、100μg／ml的細(xì)胞松馳素B、Dmem培養(yǎng)液。 
【實驗內(nèi)容】 
一、成纖維細(xì)胞微絲的染色及其對細(xì)胞松馳素B的反應(yīng) 
(一)原理 
微絲普遍存在于多種細(xì)胞，對細(xì)胞的形狀和運動有一定作用。細(xì)胞松馳素B可與微絲的亞單位肌動蛋白結(jié)合，從而破壞微絲，改變細(xì)胞的形狀。 
(二)細(xì)胞松馳素B處理成纖維細(xì)胞與染色觀察 
1．在平皿中有三張成纖維細(xì)胞貼壁生長的蓋片，在超凈工作臺內(nèi)將一張蓋片移入另一皿中繼續(xù)培養(yǎng)，用作對照。 
2．在有兩片的平皿內(nèi)加100μg／ml的細(xì)胞松弛素B 4滴繼續(xù)培養(yǎng)半小時。 
3. 將用細(xì)胞松弛素B處理過的兩張蓋片取一張做染色處理，另一張用培養(yǎng)液洗五次（在平皿內(nèi)換五次培養(yǎng)液，每次都要搖動），繼續(xù)培養(yǎng)、觀察。兩小時后細(xì)胞形狀恢復(fù)，接近正常。 
4．對恢復(fù)的蓋片與*張沒用藥的蓋片一同做染色處理。 
5．染色處理 
①將需染色的蓋片放入盛有PBS的平皿內(nèi)用吸管輕輕吹洗蓋片，換液三次，每次3分鐘，洗去培養(yǎng)液。 
②將蓋片移入2％Triton X一100液，置37℃恒溫箱內(nèi)處理20～30分鐘，以提取骨架以外的蛋白質(zhì)，使骨架圖像清晰。 
③立刻將蓋片移入M一緩沖液，換洗三次，每次3分鐘。M一緩沖液有穩(wěn)定細(xì)胞骨架的作用。 
④將蓋片移入3％戊二醛固定15分鐘。 
⑤將蓋片移入0.2％考馬斯亮蘭染液中，染色15分鐘。然后小心地用自來水沖洗，空氣干燥。 
(三)結(jié)果 
光鏡觀察，微絲聚集成的張力纖維束被染成藍(lán)色。在沒用藥的標(biāo)本上，成纖維細(xì)胞多數(shù)有突起，微絲沿突起規(guī)則排列；用細(xì)胞松馳素B處理的標(biāo)本，由于微絲被破壞突起縮回，多數(shù)細(xì)胞形狀變圓；用藥處理后又洗去藥的標(biāo)本，由于解除了藥的作用，肌動蛋白重新聚臺形成微絲，細(xì)胞形狀恢復(fù)正常。 
二、麗藻細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)環(huán)流及其對細(xì)胞松弛素B的反應(yīng) 
(一)原理 
麗藻細(xì)胞大，整個細(xì)胞的為大液泡占據(jù)?？拷号菔且粚尤苣z樣流動的內(nèi)質(zhì)，在內(nèi)質(zhì)與質(zhì)膜之間，為靜止的外質(zhì)，其中含有葉綠體。內(nèi)質(zhì)中含有許多顆粒，可以清楚地看到胞質(zhì)環(huán)流。在麗藻細(xì)胞中的微絲與胞質(zhì)環(huán)流有密切關(guān)系。成束的微絲出現(xiàn)在外質(zhì)與內(nèi)質(zhì)接口(溶膠和凝膠接口)并交織一起，與環(huán)流方向平行。用細(xì)胞松弛素B處理后，就可抑制胞質(zhì)的環(huán)流運動。 
(二)方法 
1．剪下一小塊麗藻葉片(1～2cm)，置于載片上，蓋上蓋片。 
2．觀察（陽光充足時效果較好）。 
3．再取一塊麗藻葉片，滴一滴細(xì)胞松弛素B，10~15分鐘后蓋上蓋片，觀察。 
4．洗去藥物，再觀察。 
(三)結(jié)果 
在麗藻內(nèi)質(zhì)中可以看到胞質(zhì)環(huán)流，用細(xì)胞松弛素B處理后，胞質(zhì)環(huán)流停止，洗去藥物，又出現(xiàn)胞質(zhì)環(huán)流。 
三、微絲的電鏡照片觀察 
恒河猴脊髓內(nèi)神經(jīng)纖維中微絲電鏡照片，可見微絲是實心結(jié)構(gòu)，直徑5～8cm，它均勻地分散于細(xì)胞基質(zhì)中，或排列成束和網(wǎng)狀。