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全血標(biāo)本DNA PCR反應(yīng)模板的制備
點(diǎn)擊次數(shù)：426 發(fā)布時間：2012-9-6
全血標(biāo)本DNA PCR反應(yīng)模板的制備
試劑與配制
蛋白酶K：20mg/L 溶于10mmol/L Tris-HCl pH7.5
TE緩沖液（pH7.5 或8.0）
PBS（磷酸鹽緩沖液）
鉀緩沖液：50mmol/L KCl，10～20mmol/L Tris-Cl，2.5mmol/L MgCl（pH8.3），1%laureth12，0.5% Tween-20，蛋白酶K（100μg/ml）
裂解緩沖液：0.32mol/L蔗糖，10mmol/L Tris-Cl，5mmol/LMgCl2，1% Triton-100
操作方法
方法一
1. 無菌取血200μl置于含有50μl15%EDTA的EP管中混勻；
2. 12000rpm離心5min，棄上清；
3. 將細(xì)胞團(tuán)懸浮于50μl溶液（10mmol/L Tris-HCl pH7.6，5mmol/L MgCl2， 10mmol/L NaCl） 中，12000rpm離心5s，去上清；
4. 重復(fù) （3） 2～3次；
5. 將沉淀的細(xì)胞懸浮于100μl雙蒸水中，煮沸5min；
6. 12000r/min離心5min，去細(xì)胞碎片；
7. 取上清2～5μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
方法二
1. 取全血50μl于微量離心管中，加入0.5μlTE混勻；
2. 12，000g 離心10s，棄上清，加入0.5μlTE懸浮沉淀，再離心，重復(fù)此步驟2次以上；
3. 用100μl鉀緩沖液懸浮沉淀，56℃水浴45min，消化細(xì)胞；
4. 95℃ 保溫10min，滅活蛋白酶K，取10μl上清進(jìn)行100μl PCR反應(yīng)。
方法三
1. 在微量離心管中，將0.75ml全血和0.75ml裂解液混勻；
2. 10,000g離心30s，去上清，加入1.5ml裂解液懸浮沉淀。重復(fù)此步驟2次；
3. 用117μl含1%SDS的10mmol/L的Tris-Cl（pH8.0）緩沖液溶解沉淀，70℃水浴5min；
4. 冷至55℃，加入4μl蛋白酶K液，55℃1hr；
5. 95℃ 保溫10min，滅活蛋白酶K；
6. 加入2mol/L KCl 30μl，冰浴5min；
7. 10,000g離心5min，上清分裝后于-70℃儲存?zhèn)溆谩?/p>
方法四
1. 取20μl冷凍保存血或EDTA抗凝血，點(diǎn)加于2.5cm2玻璃纖維濾膜上，晾干；
2. 用鉛筆沿血跡劃一圓圈，將濾膜置于多孔支持物上，用蒸餾水裂解；
3. 用鹽水或水浸洗，除去抑制PCR的蛋白質(zhì)成分；
4. 晾干后，切取1/8的斑點(diǎn)置于PCR反應(yīng)液中進(jìn)行PCR。