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大鼠嗅球成鞘細(xì)胞分離培養(yǎng)方法

1. 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑
出生7-9d大鼠幼仔、手術(shù)器械、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清FBS、0.125%*、PBS等包被：Poly-L-Lysine多聚賴(lài)氨酸，儲(chǔ)存液濃度為4mg/ml，超純水稀釋?zhuān)?:300）。使用時(shí)濃度為13.3ug/ml。24孔板每孔加50ul室溫孵育1h后吸去，超純水清洗后吹干。
 
DMEM培養(yǎng)基10ml，添加劑：*（146.15）2mmol/L0.3mg/ml ，牛胰島素 10ug/ml ，人轉(zhuǎn)鐵蛋白 100ug/ml， 硒（172.94） 0.224umol/L，0.04ug/ml 3,3',5-L-三碘甲狀腺原氨酸（672.96） 0.49umol/L，0.33ug/ml
 
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 脫頸處死大鼠幼仔，固定在手術(shù)板上，用75%乙醇噴灑頭部皮膚消毒
1.2.2 剪去頭部皮膚，然后作環(huán)形切口，除去顱蓋，在鼻尖處顯露腦和兩個(gè)嗅球
1.2.3 從腦部輕輕取下嗅球，用PBS清洗2~3遍，除去血塊和毛細(xì)血管等
1.2.4 剪碎組織塊,用濃度為0. 125 %的*37 ℃水浴消化15-20 min
1.2.5終止消化后輕輕吹打嗅球組織，過(guò)濾后離心（1000 r/ min ,5 min） 去除上清液,重復(fù)1-2次
1.2.6 重懸細(xì)胞沉淀，接種到多聚賴(lài)氨酸包被過(guò)的24孔板種，一只幼仔可接1~2孔，每天換液并觀察培養(yǎng)結(jié)果
 
2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
接種后觀察，細(xì)胞密度較高，同時(shí)血細(xì)胞較多；1 h后細(xì)胞開(kāi)始貼壁，呈球形，難以辨認(rèn)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。24h后細(xì)胞大多貼壁，未出現(xiàn)形態(tài)。兩至三天后細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，生長(zhǎng)較好，成纖維細(xì)胞較少。
 
3.討論
接種12 h 后有少量細(xì)胞貼壁, 懸浮細(xì)胞多見(jiàn)；24 h 后可見(jiàn)貼壁細(xì)胞增多，少數(shù)細(xì)胞變形, 呈長(zhǎng)梭形；2 d 后變形細(xì)胞多見(jiàn), 突起延伸變長(zhǎng)；另可見(jiàn)極少數(shù)胞體大而圓、突起較多但較短的細(xì)胞， 確定為神經(jīng)元。

1周后,細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，主要分為兩種：?jiǎn)螛O或雙極細(xì)胞 ，胞體類(lèi)似圓形，突起細(xì)長(zhǎng)，排列不規(guī)則，突起互相交織成網(wǎng)狀，這種細(xì)胞數(shù)量zui多；還有一種“煎蛋樣”細(xì)胞，胞核大，胞質(zhì)散鋪圍繞在胞核周?chē)?邊界不規(guī)則， 突起不明顯，形狀很似荷包蛋,故稱(chēng)“煎蛋樣”細(xì)胞。這種細(xì)胞也較常見(jiàn)。這兩種細(xì)胞常獨(dú)立成片，少見(jiàn)交叉生長(zhǎng)。

神經(jīng)元胞體大，數(shù)量少，容易辨認(rèn)。另外，還可見(jiàn)扁平長(zhǎng)梭形細(xì)胞緊密貼壁，片狀生長(zhǎng)，分裂迅速，此為成纖維細(xì)胞，這種細(xì)胞在*剝離外膜的狀況下并不多見(jiàn)。還有一種多突起呈星狀的細(xì)胞, 為星形膠質(zhì)細(xì)胞, 此類(lèi)細(xì)胞數(shù)量極少, 單個(gè)出現(xiàn), 容易辨認(rèn)。
 
嗅鞘細(xì)胞的純度隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)有所下降, 其zui主要的原因是雜細(xì)胞的生長(zhǎng)及雜質(zhì)的增多, 主要是成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，還有一些膠質(zhì)細(xì)胞。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng), 殘留的部分成纖維細(xì)胞迅速增殖，造成污染。且雜質(zhì)增多，使視野不清，純度下降。
 
不同的培養(yǎng)板OECs的形態(tài)有所不同，在未經(jīng)多聚右旋賴(lài)氨酸處理的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)的嗅鞘細(xì)胞，不但細(xì)胞增殖能力差，細(xì)胞形態(tài)與經(jīng)賴(lài)氨酸處理過(guò)的培養(yǎng)板培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)也有很大差別，細(xì)胞突起不能*伸展，變的粗短，沒(méi)有明顯的細(xì)長(zhǎng)突起編織成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

研究表明，經(jīng)多聚右旋賴(lài)氨酸包被的培養(yǎng)板比多聚左旋賴(lài)氨酸處理的培養(yǎng)板更利于嗅鞘細(xì)胞的生長(zhǎng)。