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*的操作方法
點擊次數(shù)：1250 發(fā)布時間：2012-11-23
全套操作約需1小時，分勻漿、細胞裂解、除蛋白、DNA純化等步驟，詳細說明如下。
一.勻漿和細胞裂解。
使用不同的實驗材料需采用不同的勻漿步驟，具體說明如下：
【從動物組織中提取基因組DNA】
使用研缽進行勻漿時：
①取1～100mg的動物組織或人組織移入冰浴預(yù)冷的研缽中，快速用力展研成勻漿。
注）下列組織請加液氮研磨至粉末狀。
A．富含DNA酶的胰臟、脾臟、胸腺、淋巴等組織。
B．富含膠原蛋白的皮膚、肌腱等組織。
C．富含角質(zhì)蛋白的組織或堅硬的組織（如骨骼）等。
?、诩尤?50μl的SolutionA和0.9μl的RNaseA1，溫和研磨30秒鐘。
注）使用上述①-注）的實驗材料時，請在加入SolutionA及RNaseA1后，將研缽置于65℃水浴上研磨1分鐘。
?、凼占?50μl研磨好的組織勻漿液移至CollectionTube中。如果勻漿體積不足650μl，請補充SolutionA至650μl，65℃保溫5分鐘。
二.使用研磨棒進行勻漿時：
?、偃?～100mg的動物組織或人組織移入冰浴預(yù)冷的CollectionTube中，用研磨棒快速研磨成糊狀。
②加入350μl的SolutionA和0.9μl的RNaseA1后用研磨棒快速研磨成勻漿。
③加入350μl的SolutionA將研磨棒上的勻漿沖入CollectionTube中，充分振蕩混合后，65℃保溫5分鐘。
【從植物材料或植物培養(yǎng)細胞中提取基因組DNA】
?、侔聪卤矸Q取適量的新鮮植物材料（如選用的是冷凍干燥植物材料，則用量減半），剪成小塊放入研缽中，加入液氮，待樣品冷凍*后快速、用力研磨至粉末狀。研磨時應(yīng)間斷加入液氮以防止材料融化。
植物材料種類
植物材料使用量*
植物花、葉片
10～100mg
植物莖
60～240mg
植物根
80～240mg
植物種子
80～240mg
*如選取植物的根、種子等樣品時，因其基因組DNA含量很低，需使用超過表格中所示的參數(shù)用量，此時請分兩管進行步驟1～6的實驗操作，在步驟7的操作中再將各管溶液分次加入至同一SpinColumn中過濾，使各管的基因組DNA結(jié)合到同一個SpinColumn上。
如從培養(yǎng)的植物細胞中提取基因組DNA，請離心收集2×103～1×107的培養(yǎng)植物細胞，加入150μl水充分懸浮細胞后移入研缽中，加入液氮后快速、用力研磨至粉末狀。
注）樣品研磨應(yīng)充分，否則將會嚴重影響基因組DNA的收率。
?、趯⒀欣徱浦?5℃水浴，當樣品粉末剛開始融化時，向研缽中加入700μl的SolutionA和1.2μl的RNaseA1，用力碾磨30秒。
?、凼占?50μl研磨好的組織勻漿移至CollectionTube中。如勻漿體積不足650μl，請補充SolutionA至650μl。65℃保溫15分鐘。
注）處理富含纖維的根/莖等植物材料或富含淀粉、蛋白質(zhì)的種子等時，可延長水浴時間至60分鐘。
【從全血中提取基因組DNA】
?、偃?0～250μl的全血（含抗凝劑）加入至CollectionTube中。
?、诩尤?00μl的SolutionA。
?、奂尤?μl的RNaseA1，激烈振蕩15秒鐘后，冰浴5分鐘。
注）人與動物的抗凝全血的一次處理量為≤250μl；禽類、兩棲類的抗凝全血的一次處理量為≤10μl?！緩呐囵B(yǎng)細胞中提取基因組DNA】
三.使用懸浮培養(yǎng)的動物細胞時：
?、偈褂肅ollectionTube收集1×105～1.5×107的細胞懸浮液，5,000rpm離心5分鐘，棄上清（細胞培養(yǎng)液）。
?、诩尤?50μl的滅菌蒸餾水或PBS懸浮細胞。
?、奂尤?00μl的SolutionA和0.8μl的RNaseA1，激烈振蕩15秒鐘，然后室溫靜置1分鐘。
四.使用貼壁細胞時：
①棄盡培養(yǎng)液，向培養(yǎng)皿中加入650μl的SolutionA，室溫靜置1分鐘。
注）96孔板等的每個孔中一次容納不了650μl溶液時，請分數(shù)次處理細胞。
?、谟靡埔簶尩臉岊^吹落貼壁培養(yǎng)細胞，取650μl的細胞懸浮液轉(zhuǎn)移至CollectionTube中。
?、奂尤?.8μl的RNaseA1，激烈振蕩15秒鐘，然后室溫靜置1分鐘。
2.加入400μl的SolutionB，振蕩混合。
3.加入1ml的4℃預(yù)冷的SolutionC，充分混勻后，12,000rpm離心2分鐘。
4.棄去上層有機相，再加入1ml的4℃預(yù)冷的SolutionC，充分混勻后，12,000rpm離心2分鐘。
5.棄去上層有機相，然后將水相溶液（無色下層）轉(zhuǎn)移至置于CollectionTube上的FilterCup中，12,000rpm離心1分鐘。
注）有機相（上層）帶有顏色，請務(wù)必除盡，否則會阻礙DNA結(jié)合到DNA制備膜上。相間沉淀不必考慮，在過濾時將被去除。
6.棄FilterCup，在濾液中加入400μl的DBBuffer，混合均勻。
7.將試劑盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。將上述操作6混合溶液轉(zhuǎn)移至SpinColumn中，12,000rpm離心1分鐘，棄濾液。
8.將500μl的RinseA加入至SpinColumn中，12,000rpm離心30秒鐘，棄濾液。
9.將700μl的RinseB加入至SpinColumn中，12,000rpm離心30秒鐘，棄濾液。
注）請沿SpinColumn管壁四周加入RinseB，這樣有助于*沖洗沾附于管壁上的鹽份。
10.重復(fù)操作步驟9。
11.將SpinColumn安置于新的1.5ml的離心管上，在SpinColumn膜的*處加入50～200μl的滅菌蒸餾水或ElutionBuffer，室溫靜置1分鐘。
注）把滅菌蒸餾水或ElutionBuffer加熱至65℃使用時有利于提高洗脫效率。
12.12,000rpm離心1分鐘洗脫DNA。
如果實驗室備有適合于SpinColumn接口的負壓裝置，可從上述操作步驟6完成以后進行以下操作。
7.將試劑盒中的SpinColumn插到負壓裝置的插口上，將上述操作步驟6的混合溶液轉(zhuǎn)移到SpinColumn中，開啟調(diào)節(jié)負壓裝置，緩慢吸走SpinColumn中的溶液（流速控制在1滴/秒）。
8.將負壓調(diào)至zui大，向SpinColumn中加入500μl的RinseA，吸盡SpinColumn中溶液。
9.向SpinColumn中加入700μl的RinseB，吸盡SpinColumn中溶液。
注）請沿SpinColumn管壁四周加入RinseB，這樣有助于*沖洗沾附于管壁上的鹽份。
10.重復(fù)操作步驟9。然后從負壓裝置上取下SpinColumn，將其安置于試劑盒中的CollectionTube上，12,000rpm離心1分鐘。
11.將SpinColumn安置于新的1.5ml的離心管上，在SpinColumn膜的*處加入50～200μl的滅菌蒸餾水或ElutionBuffer，室溫靜置1分鐘。
注）把滅菌蒸餾水或ElutionBuffer加熱至65℃使用時有利于提高洗脫效率。
12.12,000rpm離心1分鐘洗脫DNA。
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